鸡LIF、POUV基因克隆、生物信息学分析及原核表达

摘要

白血病抑制因子是白介素-6家族中的一种多效性细胞因子，可以多种方式作用于不同类型的细胞，其最显著的作用是可以抑制胚胎干细胞的分化并保持其增殖能力。转录因子Oct4属于POU家族中的第Ⅴ亚族，由POU5fl基因编码，由未分化的胚胎干细胞表达，其表达水平决定了胚胎干细胞的分化方向。Oct4还是制备诱导多能干细胞的关键因子。本研究的目的是克隆鸡LIF、POUV基因、对其进行生物信息学分析、构建其原核表达载体并进行诱导表达。
　　 实验1.以成年鸡肝脏组织的总RNA为模板，经RT-PCR技术扩增出鸡LIF基因，将其与pEASY-T1克隆载体连接，获得重组质粒pEASY-T1-chLIF，测序并进行生物信息学分析，酶切重组质粒pEASY-T1-chLIF，获得正确克隆的鸡LIF基因，将其与pET-30a原核表达载体连接，获得重组质粒pET-30a-chLIF。结果表明:(1)构建了重组质粒pEASY-T1-chLIF和pET-30a-chLIF;克隆的鸡LIF基因全长564bp，共编码188个氨基酸，与GenBank上公布的Gallus LIF(XM_418264)相比，核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.8％、99.5％，无插入或缺失变异。(2)多物种LIF序列的比对结果表明，鸡LIF与哺乳动物的LIF保守性较低，LIF基因存在种属特异性。(3)鸡LIF蛋白理论分子量为20.885KDa，等电点为9.342。(4)鸡LIF蛋白是亲水性蛋白，没有跨膜结构域。(5)鸡LIF蛋白的二级结构由48.66％的无规则卷曲、43.32％的α-螺旋和8.02％的伸展串组成，三级结构由4个通过环连接的螺旋组成。
　　 实验2.实验方法基本同上，不同的是作为模板的总RNA是从新出壳的小公鸡睾丸组织中提取的，使用的克隆载体是pMD18-T，最后获得了重组质粒pMD18-T-chPOUV和pET-30a-chPOUV。将重组质粒pET-30a-chPOUV转化入大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导其表达，通过SDS-PAGE和Westren blot鉴定其表达的融合蛋白。结果表明:(1)构建了重组质粒pMD18-T-chPOUV和pET-30a-chPOUV;克隆的鸡POUV基因完整的开放阅读框全长888bp，共编码295个氨基酸。与GenBank上公布的Gallus POUV(NM_001110178)相比，核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.4％、98.6％。克隆的鸡POUV基因全序列无插入或缺失变异。(2)多物种POUV序列的比对结果表明，POUV基因存在种属特异性，鸡POUV与哺乳动物的POUV有一段高度保守的氨基酸序列位于鸡POUV的第83～227位氨基酸，可能是鸡POUV蛋白的功能决定域。(3)鸡POUV蛋白理论分子量为33.229KDa，等电点为9.791。(4)鸡POUV蛋白是亲水性蛋白，没有跨膜结构域，其氨基酸序列的N端没有信号肽。(5)鸡POUV蛋白的二级结构由53.22％的无规则卷曲、33.56％的α-螺旋和13.22％的伸展串组成，三级结构由两个多螺旋结构中间通过环连接组成。(6) SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明重组质粒pET30a-chPOUV在大肠杆菌中成功表达，表达的融合蛋白His-chPOUV相对分子量约为41kDa。
　　 总而言之，本实验克隆了鸡LIF和POUV基因，并构建了相应的原核表达载体，且对POUV进行了原核表达，为进一步纯化鸡LIF蛋白，制备鸡POUV多克隆或单克隆抗体，进而用于鸡胚胎干细胞培养和诱导的多能性干细胞研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 白血病抑制因子(LIF)、转录因子Oct4的研究进展

1．1 白血病抑制因子(LIF)的研究进展

1．1．1 白血病抑制因子(LIF)的结构特征

1．1．2 白血病抑制因子(LIF)的作用机制

1．2 转录因子Oct4的研究进展

1．2．1 转录因子Oct4的结构特征

1．2．2 转录因子Oct4的作用机制

1．3 白血病抑制因子(LI F)、转录因子Oct4与胚胎干细胞(ESCs)

1．3．1 白血病抑制因子(LIF)途径

1．3．2 转录因子Oct4途径

1．4 转录因子Oct4与诱导多能干细胞(iPS Cells)

1．5 本课题研究的目的和意义

第二章 鸡白血病抑制因子(chLIF)的克隆、生物信息学分析及原核表达载体构建

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 样品、载体与菌株

2．2．2 主要试剂及其配制方法

2．2．3 主要实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 鸡白血病抑制因子(chLIF)的克隆

2．3．2 鸡白血病抑制因子(chLIF)的生物信息学分析

2．3．3 鸡白血病抑制因子(chLIF)原核表达载体的构建

2．4 结果

2．4．1 鸡白血病抑制因子(chLIF)的克隆

2．4．2 鸡白血病抑制因子(chLIF)的生物信息学分析

2．4．3 鸡白血病抑制因子(chLIF)原核表达载体的构建

2．5 讨论

2．6 结论

第三章 鸡转录因子POUV的克隆、生物信息学分析及原核表达

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 样品、载体与菌株

3．2．2 主要试剂及其配制方法

3．2．3 主要实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 鸡转录因子POUV的克隆

3．3．2 鸡转录因子POUV的生物信息学分析

3．3．3 鸡转录因子POUV的原核表达

3．4 结果

3．4．1 鸡转录因子POUV的克隆

3．4．2 鸡转录因子POUV的生物信息学分析

3．4．3 鸡转录因子POUV的原核表达

3．5 讨论

3．6 结论

参考文献

致谢

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