胶原肽的制备及其促进成骨细胞增殖分化活性研究

摘要

胶原蛋白是骨有机基质的重要组成部分,其水解产物胶原肽具有促进氨基酸吸收和蛋白质合成、抗骨质疏松、降血压、抗氧化等生理活性。本文利用水产加工副产物罗非鱼皮为原料制备胶原肽,通过研究胶原蛋白肽的制备工艺,探究胶原肽促进成骨细胞增殖分化活性,以期获得具有特定功效的胶原肽产品,提高罗非鱼副产物的附加值。
　　文章分析了罗非鱼皮原料的基本组成。鱼皮干基中蛋白质占90.30％,其中胶原蛋白含量占总蛋白66.90%。采用石油醚脱脂48h以净化胶原基质,脱脂率达62.2%。比较四种商品酶制剂对罗非鱼皮的水解能力,其中动物蛋白酶和风味酶水解度较高。采用正交实验分别对两种酶水解条件优化,结果显示两种酶最适水解条件一致。采用动物蛋白酶和风味酶双酶复合水解,酶用量均为4000U/g蛋白,在55℃、pH7.5下对罗非鱼皮水解不同时间(5h、8h、22h),比较所得胶原肽(H5、H8、H22)对大鼠成骨细胞增殖分化活性的影响,以Ⅰ型胶原酶酶解罗非鱼皮5.5h制得的胶原肽 Hc为阳性对照。结果表明,随酶解时间延长,胶原肽促进成骨细胞增殖活性提高,其中H8、H22(1mg/mL)增殖率分别为140.35%和144.21%,两者差异不显著,但与空白对照组有显著差异;同时两者对成骨细胞分化均具有一定的促进作用。
　　对H5、H8、H22的水解度、相对分子质量分布和氨基酸组成进行分析。结果显示,随酶解时间延长,水解度提高,相对分子质量降低,H5、H8、H22相对分子质量小于1000Da的组分分别占94.73%、95.56%、97.58%,平均相对分子质量分别为351.39Da、324.67Da、253.06Da。同时,H5、H8、H22的氨基酸组成较接近,符合典型水产胶原蛋白的氨基酸组成,但也有一定的差异,脯氨酸的含量逐渐降低,羟脯氨酸含量增多。
　　将H8先采用截留分子量为800-1000Da纳滤膜进行分级,收集渗透液1(Permeate1,P1)和截留液1(Retentate1,R1),比较两者活性强弱;将活性强的组分用截留分子量为400-600Da纳滤膜进行分级,收集渗透液2(Permeate2,P2)和截留液2(Retentate2,R2),比较两者活性强弱。结果表明与R1相比,P1促进成骨细胞增殖分化活性较强,细胞增殖率和分化促进率分别达126.92%和131.77%。R2与P2对成骨细胞增殖分化均有一定的促进作用,但P2活性更强,细胞增殖率和分化促进率分别达130.48%和120.72%,均达到了Hc的活性水平。
　　对R2、P2的相对分子质量分布和氨基酸组成进行分析。结果显示,两者存在较大差异。P2相对分子质量小于1000Da的组分占98.65%,平均相对分子质量为184.62Da;R2相对分子质量小于1000Da的组分占96.14%,平均相对分子质量为319.59Da。氨基酸组成方面,P2中甘氨酸和丙氨酸共占67.2%,其余氨基酸中只有脯氨酸含量超过5%,达到6.1%,另外胶原蛋白的特征氨基酸羟赖氨酸含量增加了125%;R2中除脯氨酸含量增加了30%、羟赖氨酸增加100%外,其他均与H8接近。胶原肽促进成骨细胞增殖分化的活性或许跟这两种氨基酸,或含有这两种氨基酸的多肽有关。
　　P2活性虽然最高,但得率极低。而P1与R2活性差异不大,考虑成本问题,选择P1作为最终精制肽。根据整个工艺制备出的胶原多肽色泽均匀、粉末细腻,溶解性好,达到SB/T10634-2011《淡水鱼胶原蛋白肽粉》对一级产品的质量要求,胶原粗肽得率为18.20%,精制肽得率为6.67%。

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第一章 绪 论

1.1胶原蛋白研究进展

1.2 胶原蛋白肽研究进展

1.3 骨骼代谢

1.4 选题的背景、意义及主要研究内容

第二章 罗非鱼皮胶原蛋白肽制备工艺的研究

2.1 前言

2.2 材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 小结

第三章 不同酶解时间胶原肽促进成骨细胞生长分化作用活性的研究

3.1 前言

3.2 材料与设备

3.3 实验方法

3.4 实验结果与分析

3.5 小结

第四章 罗非鱼皮胶原肽的分级纯化及其促进成骨细胞生长分化作用活性的研究

4.1 前言

4.2 材料与设备

4.3 实验方法

4.4 实验结果与分析

4.5小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 不足与展望

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢