水牛体外成熟卵母细胞iTRAQ定量蛋白质组及其质量控制方法的研究

摘要

作为一种高度特化的雌性生殖细胞，哺乳类动物卵母细胞是动物个体发生的主体细胞。大量研究表明，卵母细胞的成熟质量与其受精后胚胎发育能力直接相关，同时体外成熟的卵母细胞是体外受精、体外胚胎生产、胚胎移植等一系列胚胎生产技术研究的基础。然而，与体内成熟相比，目前大家畜卵母细胞体外成熟效率、囊胚发育率、母体受孕率均较低。这与卵母细胞核质成熟不同步、细胞质成熟不充分、体外成熟体系不完善有关，同时有关大家畜卵母细胞成熟分子机制尚不完全清楚也是关键因素之一。卵子在生长和成熟过程中逐步获得成熟、受精和胚胎发育的能力，这些能力的获得与蛋白质合成、修饰、降解和聚积密切相关。因此，应用蛋白质组学技术研究卵母细胞成熟过程中蛋白质合成代谢变化规律将有望进一步揭示卵母细胞成熟的分子机制，对提高卵母细胞体外成熟质量具有重要意义。
　　本研究以具有地方特色的广西本地水牛为对象，应用iTRAQ定量蛋白质组学技术对体外成熟前后、胞质正常与异常的水牛卵母细胞进行蛋白质组学研究。构建成熟前、后水牛卵母细胞蛋白质组表达谱，鉴定体外成熟前后卵母细胞表达差异蛋白。通过生物学信息学分析，研究差异蛋白在水牛卵子成熟过程中的功能及参与的生物学途径，以确定与水牛卵母细胞成熟相关的重要蛋白，并揭示水牛卵母细胞体外成熟的分子机制。
　　首先，应用一维凝胶电泳结合LC-MS/MS技术构建成熟前、后水牛卵母细胞蛋白质组表达谱。分别从体外成熟前、后的水牛卵母细胞中鉴定到647和570(FDR＜1％)种蛋白质，其中相同鉴定蛋白414种，占总鉴定蛋白的51.6％。成熟前后的水牛卵子中均有9种高丰度表达蛋白质，其中8种为相同鉴定蛋白，包括穹窿体蛋白、谷胱甘肽S-转移酶M3、醛糖还原酶、过氧化物还原酶2、二磷酸核苷酸激酶B、动力蛋白轻链1、蛋白精氨酸脱亚氨酶6、类甘油醛-3-三磷酸脱氢酶同源物2。对成熟前、后卵母细胞相同、特有鉴定蛋白的生物信息学分析发现，相同鉴定蛋白在包括丙酮酸盐代谢、糖酵解/糖原生成、TCA循环、结氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的降解、丙酸代谢、脂肪酸代谢和磷酸戊糖途径等23条KEGG信号通路显著相关(p＜0.05)。表明能量代谢途径在水牛卵母细胞成熟过程中发挥重要作用，它们为卵母细胞的成熟提供能量来源、保证卵母细胞减数分裂的完成。成熟前卵子特有鉴定蛋白与氧化磷酸化、核糖体、蛋白酶体等信号通路显著相关(p＜0.05);成熟后卵子特有鉴定蛋白与DNA复制、氨基糖和核苷酸糖代谢信号通路显著相关(p＜0.05)。结果还同时表明一些蛋白贯穿整个卵子成熟过程，并发挥重要作用。此外，卵母细胞在不同的发育时期特异表达一些蛋白，参与维持其必需的生长和发育。
　　其次，应用iTRAQ定量蛋白质组学技术对成熟前、后和胞质正常与异常的水牛卵母细胞进行了研究。从成熟前后及胞质正常与异常的水牛卵母细胞共鉴定到3857(FDR＜1％)种蛋白质，可定量蛋白数3245种。进一步分析显示，两肽段以上鉴定蛋白数达到3287种，占总鉴定蛋白的85％。与已报道的牛卵母细胞蛋白质组数据集（占总鉴定量的34％-88％）相近。胞质正常MⅡ期卵子和GⅤ期卵子比较筛选出173种差异表达蛋白，其中上调表达108种，下调表达65种。胞质正常与胞质异常的MⅡ期水牛卵子比较筛选出146种差异表达蛋白，其中111种上调表达，35种下调表达。胞质正常MⅡ期卵子和GⅤ期卵子的差异表达蛋白GO分析显示，上调蛋白主要参与基于微管过程、蛋白质转运、能量产生和物质代谢及细胞周期等生物学进程。胞质正常MⅡ期卵子与胞质异常MⅡ期卵子比较的差异表达蛋白GO分析显示，上调蛋白主要参与氧化还原、翻译、蛋白质转运、氧化磷酸化及小G蛋白信号转导途径等生物学进程。相较于GⅤ期细胞和胞质异常MⅡ期卵母细胞，氧化磷酸化信号通路中参与电子转运呼吸链的关键酶在胞质正常MⅡ期细胞中表达均显著上调。表明氧化磷酸化水平显著影响水牛卵子的成熟质量，是卵子减数分裂和发育能力的重要过程;表明卵母细胞减数分裂成熟过程需要大量的能量供给，提示MⅡ期卵母细胞在为随后的受精过程所需的能量代谢做充分的准备。
　　在上述研究过程中发现，样品中小分子量、低丰度蛋白在进行质谱鉴定时，产生可测序肽段的数量少，其信号极易受高丰度蛋白信号的抑制和掩盖，致使小分子量、低丰度蛋白无法被鉴定出来，而这些小分子量、低丰度蛋白又具有极其重要的生理功能。为此，研究发展了一种能有效分离、富集小分子量、低丰度蛋白质和去除高丰度蛋白的“Gel-filter”的凝胶分离方法。结果显示，随着血清样品上样量的增加，小分子量蛋白条带逐渐加深，表明随着蛋白量的增加，富集效果明显。经过该方法处理的样品，蛋白质相对丰度不发生改变。将该方法与文献报道的其他三种常用分离方法进行了比较，并利用质谱技术进行鉴定分析。结果显示，Gel-filter方法共鉴定到559(FDR＜1％)种血清小分子量蛋白质，为四种方法中鉴定数最高。对鉴定的小分子量蛋白、肽段进行分子量分布分析显示，在各分子量区间，Gel-filter方法的鉴定数为四种方法中最高。以谱图数表示蛋白的丰度并进行归一化后对四种方法共同鉴定的小分子量蛋白丰度分布进行分析，Gel-filter方法富集的小分子量蛋白丰度分布范围相对较宽。通过Gel-filter方法富集到的小分子量蛋白可获得更高的蛋白序列覆盖度。为进一步评估不同方法小分子量蛋白的回收效率，通过在血清样品中加入大肠杆菌诱导表达的轻稳定同位素标记的GST蛋白(26kDa)后，分别经不同方法处理。质谱鉴定分析显示，Gel-filter方法处理GST蛋白的回收效率为33.1±0.01％，显著高于Differential solubilization(DS)和ProteoMiner试剂盒方法，后两种方法处理GST蛋白的回收效率分别为18.7±0.01％和9.6±0.03％。上述结果表明，Gel-filter方法作为一种操作简便、有效以及重现性好的分离富集方法，可为蛋白质组学的研究提供有效的工具。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 哺乳动物卵母细胞发生过程

1．2 卵母细胞成熟过程分子调控机制

1．2．1 GV期阻滞维持

1．2．2 减数分裂恢复与进行

1．3 蛋白质组学研究概述

1．4 定量蛋白质组学研究进展

1．4．1 相对定量

1．4．2 绝对定量

1．5 哺乳动物卵母细胞蛋白质组学研究的意义

1．6 哺乳动物卵母细胞蛋白质组学研究进展

1．6．1 蛋白质组学与哺乳动物卵母细胞质量

1．6．2 蛋白质组学与哺乳动物卵母细胞成熟

1．6．3 哺乳动物卵母细胞和颗粒细胞蛋白质组

1．6．4 体外培养卵母细胞蛋白质组

1．6．5 卵母细胞体外受精与蛋白质组

1．6．6 表观遗传相关蛋白：母源效应蛋白组

1．6．7 哺乳动物早期胚胎蛋白质组

1．7 血清蛋白质样品预处理方法研究进展

1．7．1 超滤管法

1．7．2 有机溶剂沉淀法

1．7．3 免疫亲和去除法

1．7．4 组合肽文库法

1．7．5 电泳凝胶分离法

1．8 研究目的、意义

1．9 研究内容

第二章 成熟前后水牛卵母细胞蛋白质表达谱的构建

2．1．1 材料来源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．2 成熟前后水牛卵母细胞蛋白质表达谱

2．2．3 成熟前后水牛卵母细胞蛋白质GO聚类分析

2．2．4 成熟前后水牛卵母细胞蛋白质参与的信号通路分析

2．2．5 GV期和MⅡ期水牛卵母细胞高丰度表达蛋白质

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 基于iTRAQ技术的成熟前后和胞质正常与异常的水牛卵母细胞定量蛋白质组研究

3．1 材料与方法

3．1．3 主要仪器

3．1．4 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 SDS-PAGE分离结果

3．2．2 iTRAQ标记及第一维反相液相分离

3．2．3 LC-MS／MS鉴定结果

3．2．4 不同哺乳动物卵母细胞蛋白质组数据集比较

3．2．5 水牛卵母细胞蛋白质表达谱GO分析及KEGG通路分析

3．2．6 差异表达蛋白质筛选

3．2．7 差异表达蛋白GO分析

3．2．8 差异表达蛋白质KEGG pathway分析

3．2．9 差异表达蛋白的相互作用分析

3．2．10 qRT-PCR技术验证差异表达蛋白mRNA表达水平

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 小分子量蛋白质不同分离富集方法的比较研究

4．1 材料与方法

4．1．1 血清样本、菌株与质粒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 Gel-filter方法的建立

4．2．2 不同血清小分子量蛋白质富集方法电泳结果比较

4．2．3 LC-MS／MS鉴定结果

4．2．4 不同血清小分子量蛋白质富集方法质谱鉴定结果比较

4．2．5 不同血清蛋白质组数据集的比较

4．2．6 不同富集方法小分子量蛋白质回收率的比较

4．3 讨论

4．4 小结

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术成果

致谢