FGF10在水牛卵泡发育中的表达模式及其对水牛卵母细胞体外成熟的影响

摘要

卵母细胞的体内成熟是在卵泡的微环境中完成，而卵母细胞的体外成熟则缺少这样的生理环境，故其成熟率和发育潜能均低于体内成熟的卵母细胞。为此，许多研究者尝试改良体外成熟培养条件来改善卵母细胞的体外成熟效果。现已有报道证明FGF10影响卵丘细胞的凋亡，促进卵母细胞的成熟，但有关水牛的研究仍鲜有报道。因此，本研究对水牛FGF10的结构特点及在卵泡发育中的表达规律进行了分析，并探讨了FGF10对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其介导的Ras/MAPK通路在此过程中所起的作用，以便为优化水牛卵母细胞体外培养体系，提高卵母细胞的体外成熟效率奠定理论基础。研究主要获得如下结果: 1.水牛FGF10基因编码区的克隆与分析。以水牛卵巢的总RNA为模板，克隆得到水牛FGF10基因CDS区全长序列，并应用生物信息学软件对其分析。结果显示:克隆得到水牛FGF10基因的编码区全长642bp，编码213个氨基酸。多重序列比对发现水牛FGF10基因核苷酸序列与黄牛、猪、羊、人的同源性分别达到了99％、93％、99％和91％。系统进化树分析显示水牛和黄牛亲缘性最近。蛋白特性分析该蛋白为等电点是9.61的碱性蛋白。蛋白结构预测发现，其为分泌性蛋白，并包含有7个α-螺旋、10个无规则卷曲、12个T-转角和18个β-折叠。 2.分析了FGF10及其受体在水牛组织和卵泡中的表达情况。结果显示，FGF10及其受体FGFR2b在睾丸和卵巢中表达量较高，在水牛各级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞，以及成熟卵泡的基膜细胞中均呈现免疫组织化学阳性。检测不同直径卵泡颗粒细胞中的FGF10及其受体的mRNA表达情况发现，在不同直径卵泡颗粒细胞中均未检测到FGF10的表达，而FGFR1及FGFR1b在直径Φ≤2mm及6＜Φ≤8mm的卵泡中表达较高，在2＜Φ≤4mm卵泡颗粒细胞中表达量最低;FGFR2及FGFR2b在2＜Φ4mm卵泡颗粒细胞中表达量最低，在4＜Φ≤6mm卵泡颗粒细胞中的表达量最高。检测FGF10及其受体在水牛COCs中的表达情况，结果显示随着COCs体外成熟培养时间的增加，FGF10及其受体的mRNA表达量逐渐升高，且体外成熟后显著高于成熟前(P＜0.05)。 3.探讨了FGF10对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其作用机理。结果发现，水牛COCs经不同浓度FGF10重组蛋白(0、0.5、5、50ng/mL)体外成熟培养24h后，5ng/mL FGF10处理组中卵母细胞第一极体排出率(79.04％vs59.33％)、卵丘细胞的扩展(2.78vs2.64)及其随后IVF胚胎的分裂率(83.75％vs74.48％)和囊胚率(30.56％vs20.48％)均显著高于对照组(P＜0.05)，但对裸卵的成熟率无显著性影响(48.04％vs46.01％,P＞0.05)。地衣红染色结果显示:5ng/mL FGF10处理组卵母细胞的核成熟率(79.17％vs63.54％，P＜0.05)及MPF活性均显著地高于对照组。TUNEL凋亡检测发现，5ng/mL FGF10处理组的卵丘细胞凋亡率显著低于对照组（P＜0.05）。检测卵丘细胞中凋亡与增殖相关基因及卵丘扩展相关基因的表达发现，经FGF10处理后能降低Bad、CTSB mRNA的表达水平，且提高了Bcl-2、Spry1、Spry2、Spry3、HAS2、PTGS2、PTX3mRNA的表达水平。此外，5ng/mL FGF10处理组能显著提高COCs对葡萄糖的利用率(1182.23vs803.76pmol/COC/h，P＜0.05)，及卵丘细胞中PKM2、LDHA、G6PDH和GFPT1的表达水平(P＜0.05)。 4.探讨了FGF10所介导的Ras/MAPK信号通路在FGF10促进水牛卵母细胞体外成熟中的作用。分别用不同浓度的Ras/MAPK信号通路抑制剂U0126（0、10、20、50、100μM）处理水牛COCs24h后，其第一极体排出率(32.33％，29.04％，30.06％，10.86％vs57.04％)、卵丘细胞的扩展程度(2.05，1.47，1.25，1.01vs2.56)、及随后胚胎的囊胚率(11.39％，12.50％，7.30％，0％vs19.56％)和囊胚细胞数目(131.86，137.90，126.67，0vs199.15)均随U0126浓度的增加而显著降低(P＜0.05)。用U0126与FGF10联合处理后，其卵母细胞的第一极体排出率显著地低于对照组和FGF10处理组(37.31％vs54.04％，71.59％,P＜0.05)，而与U0126处理组差异不显著(37.31％vs31.52％，P＞0.05)。地衣红染色发现，水牛卵母细胞的核成熟率(39.62％,33.87％,28.30％,15.89％vs63.03％,P＜0.05)及MPF活性均随U0126处理浓度的增加而降低，且与对照组差异显著(P＜0.05)。检测相关基因的表达情况发现，20μM U0126处理组卵丘细胞中的MAPK、Spry1、Spry2及TSG6、PTGS2、PTX3mRNA表达水平显著低于对照组(P＜0.05)。分析体外成熟过程中葡萄糖代谢情况发现，20μM U0126对水牛COCs的葡萄糖利用率无显著性影响（870.75vs950.94pmol/COC/h，P＞0.05）。卵丘细胞凋亡检测发现，20μM U0126处理组卵丘细胞凋亡率(8.59％vs6.16％，P＜0.05)及其细胞中的Bad、Bax、CTSB mRNA表达水平均显著提高(P＜0.05)，而Bcl-2的mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)。 以上结果表明:(1)水牛FGF10的编码区全长为642bp，编码213个氨基酸，为碱性成纤维细胞生长因子;(2)FGF10及其受体在各级卵泡中均有表达，主要表达于卵母细胞、卵丘细胞和成熟卵泡的基膜细胞，并在成熟后COCs中的表达量较高;(3)体外成熟培养液中添加适当浓度的FGF10（5ng/mL）有利于水牛卵母细胞的体外成熟及其随后胚胎的发育，这一作用可能是通过提高卵丘对葡萄糖的利用、降低卵丘细胞的凋亡、促进卵丘细胞的增殖与扩展及提高卵母细胞中MPF活性而实现;(4)FGF10介导的Ras/MAPK信号通路与卵母细胞的核成熟，卵丘细胞的增殖、凋亡及扩展相关，但并非是COCs葡萄糖代谢的主要通路。

目录

声明

摘要

第一章卵母细胞体外成熟的研究进展

1卵母细胞的体外成熟及其影响因素

1．1卵子的发生

1．2卵母细胞成熟的调控机制

1．3卵母细胞的体外成熟

1．4卵母细胞体外成熟的影响因素

1．5颗粒细胞对卵母细胞成熟的影响

1．6葡萄糖代谢及其对卵母细胞体外成熟的影响

1．7卵母细胞分泌因子对卵母细胞体外成熟的影响

2．1成纤维细胞生长因子的研究进展

2．2成纤维细胞生长因子受体及其信号通路的研究进展

2．3成纤维细胞生长因子10的研究进展

研究目的和意义

第二章水牛成纤维细胞生长因子10基因编码区的克隆

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试验设计

1．3试验方法

1．4数据统计与分析

2试验结果

2．1水牛卵巢组织总RNA的提取

2．2水牛FGF10基因CDS序列的克隆

2．3水牛FGF10的生物信息学分析

3分析与讨论

4结论

第三章FGF10及其受体在水牛卵泡发育中的表达模式

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试验设计

1．3试验方法

1．4数据统计与分析

2试验结果

2．1 FGF10及其受体在水牛各组织中的表达情况

2．2 FGF10及其受体在水牛卵巢卵泡中的表达与定位

2．3 FGF10在水牛卵丘-卵母细胞复合物中的表达规律

3分析与讨论

4结论

第四章FGF10对水牛卵母细胞体外成熟的影响

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试验设计

1．3试验方法

1．4数据统计与分析

2试验结果

2．1不同浓度的FGF10及其抗体对水牛COCs体外成熟过程中卵丘细胞扩展、卵母细胞成熟及早期胚胎发育效果的影响

2．2不同浓度的FGF10对水牛裸卵体外成熟效果的影响

2．3 FGF10对水牛卵母细胞体外成熟过程中核成熟的影响

2．4 FGF10对水牛COCs卵丘细胞增殖、凋亡及扩展的影响

2．5 FGF10对水牛卵母细胞体外成熟过程中葡萄糖代谢的影响

3分析与讨论

4结论

第五章阻断Ras／MAPK信号通路对水牛卵母细胞体外成熟的影响

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试验设计

1．3试验方法

1．4数据统计与分析

2试验结果

2．1 U0126处理水牛COCs对卵母细胞体外成熟及其胚胎发育的影响

2．2 FGF10与U0126联合处理对水牛卵母细胞体外成熟的影响

2．3不同浓度的U0126对水牛卵母细胞体外成熟过程中核成熟的影响

2．4 U0126对水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展的影响

2．5 U0126对水牛卵母细胞成熟过程中Ras／MAPK信号通路上MAPK和Spry基因的影响

2．6 U0126对水牛COCs体外成熟过程中葡萄糖代谢的影响

2．7 U0126对水牛COCs中卵丘细胞凋亡的影响

3分析与讨论

4结论

全文总结

参考文献

中英文缩略表

附图

致谢

攻读博士期间发表文章