甘蔗宿根矮化病病原菌膜蛋白Lxx18460基因的特性研究

摘要

关于甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease，RSD)的分离培养、多克隆抗体的制备和检测已进行相关的研究，但有关甘蔗宿根矮化病病原菌(Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx)中推测为抗σK因子(anti-sigma Kfactor，RskA)的膜蛋白(membraneprotein，MP) Lxx18460基因单克隆抗体的制备、检测及遗传转化的研究在国内外尚未见报道。本研究在本课题组前期工作的基础上，进一步分析对该基因的特异性进行分析，诱导并纯化了去跨膜区域的Lxx18460基因可读框349-717序列(385 bp)编码的蛋白为抗原，通过多次免疫纯种BALB/C小鼠，获得其单克隆抗体;用该单克隆抗体对细菌总蛋白和感病、健康甘蔗样品总蛋白进行检测。构建了该基因的植物表达载体并转入野生型烟草，检测得到烟草转基因植株。本研究结果有助于探讨抗oK因子基因的功能及其在Lxx中的作用。主要结果如下:
　　1、将含有Lxx18460基因的pET-30a质粒的菌液，利用IPTG（浓度0.1 mM）诱导蛋白表达，收集诱导表达后的菌液于50 mL的离心管中，放在经4℃预冷的冷冻离心机内，4℃条件下，5000rpm，离心20 min，弃尽上清。并用两种不同的蛋白纯化方法对该蛋白进行纯化并比较分析，经SDS-PAGE分析鉴定结果表明，两种方法均可以纯化出目的蛋白，用改进的方法纯化出的蛋白更纯，量更多，并进一步透析和浓缩，用紫外分光光度法检测获得的浓缩后蛋白质量浓度，用来做免疫抗原。
　　2、以诱导表达的蛋白为抗原，通过多次免疫纯种BALB/C小鼠，获得了单克隆抗体。ELISA检测结果表明，其效价大于1∶512000。Western blot检测结果表明，该基因在细菌中和感病甘蔗样品中表达，在健康甘蔗样品中几乎不表达。
　　3、本研究中通过构建了Lxx18460基因的植株表达载体，构建完成后并进行了相应验证，表明载体可以用于下一步转化。进一步转化烟草获得转基因植株。对转基因植株进行了表型观察，与对照相比，转入Lxx18460基因的烟草植株，表现出明显的矮化症状，可见该基因在一定程度上抑制了烟草的生长。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 甘蔗宿根矮化病的发生及传播

1．2 甘蔗宿根矮化病的分离及培养

1．3 甘蔗宿根矮化病的检测

1．4 基因组学研究进展

1．4．1 基因测序工程

1．4．2 基因的退化与缺失

1．4．3 基因组中致病相关基因

1．4．4 基因的同源性比较

1．4．5 对寄主适应性

1．5 σ因子和抗σ因子研究进展

1．6 本实验的目的、意义及技术路线

1．6．1 本实验的目的、意义

1．6．2 技术路线

2 Lxx18460基因的纯化及PCR检测

2．1 材料

2．1．1 菌液材料

2．1．2 酶、试剂和检测设备

2．1．3 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 Lxx18460基因的PCR检测

2．2．2 Lxx18460基因的诱导表达和纯化

2．2．3 纯化蛋白的分析及质量检测

2．2．4 纯化蛋白的透析与浓缩

2．2．5 蛋白质银染

2．3 结果分析

2．3．1 样品的PCR检测结果

2．3．2 Lxx18460基因诱导表达蛋白的纯化结果

2．3．3 Lxx18460基因编码蛋白的透析和浓缩结果

2．4 小结

3 Lxx18460基因单克隆抗体的制备和检测

3．1 材料

3．1．1 材料获得及处理

3．1．2 实验试剂

3．1．3 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 抗血清的制备

3．2．2 杂交瘤细胞的培养血清的效价测定

3．2．3 杂交瘤细胞的培养血清的Western blot检测

3．2．4 杂交瘤阳性克隆的筛选

3．2．5 细菌总蛋白的SDS-PAGE鉴定和Western blot检测

3．2．6 感病和健康甘蔗茎、叶的DNA提取及PCR检测

3．2．7 感病和健康甘蔗茎、叶总蛋白的提取及SDS-PAGE鉴定

3．2．8 感病和健康甘蔗茎、叶的Western blot检测

3．3 结果分析

3．3．1 杂交瘤细胞培养血清的间接ELISA测定结果

3．3．2 杂交瘤细胞的培养血清的Western blot检测结果

3．3．3 杂交瘤阳性克隆的筛选结果

3．3．4 4B3A2单克隆抗体的Western blot检测结果

3．3．5 细菌总蛋白的SDS-PAGE鉴定和Western blot检测

3．3．6 感病和健康甘蔗茎、叶的PCR检测

3．3．7 感病和健康甘蔗茎、叶总蛋白及细菌总蛋白的SDS-PAGE检测

3．3．8 感病和健感病和健康甘蔗茎、叶总蛋白的Western blot检测

3．4 小结

4 Lxx18460基因转化烟草的研究

4．1 材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 所用菌种类

4．1．3 实验器材和试剂

4．1．4 培养基

4．2 方法

4．2．1 真核表达载体引物设计

4．2．2 Lxx18460基因ORF的扩增及目的片段的回收

4．2．3 pBI121质粒的获得

4．2．4 双酶切及目的片段的回收

4．2．5 EHA105农杆菌感受态细胞的制备

4．2．6 目的片段与载体的连接及转化

4．2．7 重组质粒的提取及酶切验证

4．2．8 烟草无菌苗制备及农杆菌介导叶盘法转化烟草

4．2．9 转基因烟草I)NA的提取

4．2．10 转基因烟草的PCR检测

4．2．11 转基因烟草表型的观察

4．3 结果和分析

4．3．1 植物表达载体的构建及检测

4．3．2 转基因烟草的获得

4．3．3 转基因烟草的检测

4．3．4 转基因烟草表型的观察

4．4 小结

5 讨论与结论

5．1 全文讨论

5．1．1 Lxx18460基因膜蛋白的纯化

5．1．2 Lxx18460基因膜蛋白单克隆抗体的制备和检测

5．1．3 Lxx18460基因转烟草的研究

5．2 全文结论

5．3 论文创新点

6 展望

致谢

参考文献

附录