甘蔗宿根矮化病病原菌Lxx18460基因的克隆和表达分析

摘要

本研究克隆了甘蔗宿根矮化病病原菌中推测为抗οK因子(anti-sigma K factor，RskA)的膜蛋白(membrane protein，MP)Lxx18460基因，分析其基因结构和在感病甘蔗体内的表达情况，构建了Lxx18460基因全长和去跨膜区域的Lxx18460基因可读框349-717序列的原核表达载体，让其在大肠杆菌中表达，纯化并鉴定表达产物，为进一步了解甘蔗宿根矮化病病原菌Lxx18460抗σK蛋白的表达调控提供理论基础和技术支持。主要结果如下：
　　 1.根据GenBank上的甘蔗宿根矮化病病原菌的Lxx18460的基因序列(NC＿006087)，设计特异性引物，以Lxx基因组DNA为模板，PCR扩增得到Lxx18460基因全长(720 bp)、含酶切位点但不含终止密码子的Lxx18460基因(736 bp)和去跨膜区域的Lxx18460基因可读框349-717序列(385 bp)。序列分析表明：扩增到的Lxx18460基因全长与NC006087的核苷酸序列同源性100％，含酶切位点但不含终止密码子的两个目的DNA序列正确。生物信息学分析得知，Lxx18460蛋白相对分子量约为24.8 kDa，理论等电点pI为5.01，为可溶性稳定蛋白；有一个跨膜区域，具体位于92-114位之间；含有一个典型的保守结构，位于第43-238位之间，为蛋白质家族RskA；氨基酸同源性分析表明，Lxx18460蛋白与其它菌种的RskA基因同源性低。
　　 2.从感染RSD的甘蔗品种GT11叶片的cDNA中，根据Lxx18460基因的首尾设计引物，PCR扩增到为一条720 bp的条带，GenBank基因登录号为JQ740153。克隆测序显示，其与GenBank公布的Lxx的核苷酸序列(NC006087)和氨基酸序列同源性均为100％。利用实时荧光定量PCR技术对Lxx18460基因在感染RSD甘蔗品种GT11成熟期茎和叶中的表达研究表明：茎、叶中均有Lxx18460基因的表达，在茎的基部第一节中其相对表达量最高，之后往尾梢方向相对表达量逐渐减少，叶中相对表达量明显比茎低，茎尖和+1叶中相对表达量最少。
　　 3.本研究成功构建了Lxx18460基因全长以及其基因可读框349-717序列的原核表达载体pET30a-MP和pET30a-MPDo在28℃和37℃条件下，3个不同浓度的IPTG均不能诱导pET30a-MP融合蛋白的表达；37℃条件下，3个不同IPTG浓度也不能诱导pET30a-MPD融合蛋白的表达；而在28℃条件下，在3个不同浓度和不同时间的IPTG诱导下，pET30a-MPD融合蛋白均表达，在1.0 mmol/LIPTG诱导6 h时其蛋白表达量最大，该重组融合蛋白分子量约27 kDa。pET30a-MPD融合蛋白被确定为以包涵体形式存在，经Ni2+-NTA纯化和质谱分析鉴定是Lxx的推测膜蛋白Lxx18460。