污染湖泊宏基因组文库中谷氨酸脱羧酶基因的克隆及功能研究

摘要

γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物的重要神经递质，具有多种保健功能。谷氨酸脱羧酶在催化谷氨酸脱去羧基后，可生成GABA。相对于化学合成法而言，利用微生物技术生产γ-氨基丁酸具有不可比拟的优越性。未培养微生物中含有大量的新基因资源，而普通的分离纯化以及纯培养技术很难将其加以利用。因此，本课题探究了通过建立宏基因组文库的办法，挖掘自然界中新的谷氨酸脱羧酶基因，这在国内外谷氨酸脱羧酶的研究中鲜有报道。
　　本课题利用酸性污染的环境样品构建了以pGEM-3Zf(+)为载体，Escherichia coli DH5α为宿主的宏基因组文库，其中总共包含1.2万个阳性克隆，容量约为50.4 Mb。通过随机测序并与GenBank数据库进行一致性比对，发现该文库中包含大量与参考序列一致性较低的新基因，证明了这一方法的有效性。
　　通过活性筛选策略，最终从文库中筛选得到了两个具有明显变色反应的阳性克隆，命名为pGEMW1和pGEMW2。将这两个阳性克隆中所包含的ORF与GenBank数据库进行一致性比对和功能鉴定，最终获得了一个编码谷氨酸脱羧酶的新基因，将其命名为gad3。该基因全长约1.4 kb，编码一条由469个氨基酸组成，分子量约为53 kDa，理论等电点为5.61的多肽链。在氨基酸水平上，它与Lactobacillus plantarum属编码的谷氨酸脱羧酶具有99％的一致性，但该基因来自于全基因组注释，并没有进行功能鉴定。
　　将gad3基因表达的重组蛋白经镍柱纯化后，对其酶学性质进行测定，发现其最适温度为37℃，最适pH值为4.7，Sr2+，Co2+，Fe2+、Zn2+、Mg2+和Zn2+对酶促反应有明显的激活作用，Al3+、Fe3+、Mn2+和Cu2+对酶促反应有明显的抑制作用。EDTA对酶活有明显的抑制作用，说明该酶对金属离子具有依赖性。纯酶的Km值为0.619 mg/mL，kcat/Km=19.483 mL/(mg·s)。与其他来源的谷氨酸脱羧酶相比较，该酶的性质参数处于中等水平。
　　本研究建立了一整套利用宏基因组文库技术克隆得到新的谷氨酸脱羧酶基因的方法，对于后续研究具有一定的借鉴意义。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 生物胺及其生理功能

1．2 γ-氨基丁酸及其生理功能

1．3 GABA的应用

1．4 GABA的合成

1．5 氨基酸脱羧酶

1．6 GABA的检测手段

1．7 本课题的发展趋势及选题意义

1．8 实验技术路线

第二章 材料与方法

2．1 主要仪器及设备

2．2 菌株和质粒

2．3 常用药品与酶制剂

2．4 抗生素的配制

2．5 培养基及溶液的配制

2．6 环境样品采集与处理

2．7 宏基因组文库及工程菌的构建

2．8 菌株保存

2．9 表达条件的优化

2．10 目的蛋白的纯化

2．11 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳

2．12 重组谷氨酸脱羧酶的酶学性质检测

第三章 结果与分析

3．1 宏基因组DNA的提取

3．2 宏基因组文库的构建

3．3 宏基因组文库的质量评估

3．4 谷氨酸脱羧酶基因的活性筛选

3．5 gad3基因的异源表达

3．6 谷氨酸脱羧酶Gad3的生物信息学分析

3．7 Gad3蛋白的酶学性质测定

第四章 总结与展望

4．1 宏基因组文库的构建及筛选

4．2 gad3基因的生物信息学分析

4．3 Gad3蛋白的酶学性质测定

4．4 展望

参考文献

附录

致谢

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