肉桂酸降解酶和(S)-1-苯乙醇氧化酶及其酶活测定方法研究

摘要

酶催化法制备天然香料和手性化合物已成为当前的热点，相对于化学法，酶法具有污染小、能耗低、得到的产物具有绿色、天然等优点。酶法用于外消旋化合物的手性拆分时立体选择性高，专一性好，该法具有广阔的应用前景。本文在微生物转化肉桂酸和拆分外消旋1-苯乙醇的基础上，开展了对Mucor sp.JX23产肉桂酸降解酶和JX13产(S)-1-苯乙醇氧化酶的相关研究。针对这两种酶建立了灵敏度高、稳定性好、准确可靠的酶活测定方法，为进一步开展酶法制备天然香料苯乙酮和单一光学活性的1-苯乙醇的研究奠定了方法学基础。主要的研究内容和成果如下:
　　1.建立了高效液相色谱法测定肉桂酸降解酶和(S)-1-苯乙醇氧化酶酶活的方法。肉桂酸降解酶酶活测定方法的的最佳色谱分析条件为:色谱柱Hypersil ODS2柱，流动相为乙腈∶水∶冰乙酸=50∶50∶0.5（体积比），流速为1.0 mL·min-1，检测波长为247 nm，柱温为30℃。(S)-1-苯乙醇氧化酶酶活测定方法的最佳色谱分析条件为:色谱柱Chiralcel OJ-RH柱，流动相为:乙腈∶水=30∶70（体积比），流速为0.7 mL·min-1，检测波长为205 nm，柱温为30℃。结果显示:利用高效液相色谱法测定酶活的方法具有稳定性高、灵敏度高、抗干扰性强等优点，为酶催化体系的分析提供了可靠的方法。
　　2.对Mucor sp.JX23菌株产肉桂酸降解酶的发酵条件进行优化，主要从碳源、氮源、反应初始pH、发酵时间、瓶装量这五个因素进行单因素条件优化。最终得到最优的培养基以甘露醇和酵母膏为碳源、氮源，初始pH为5.0，发酵时间为96 h，瓶装量为200 mL装于500 mL锥形瓶。优化后，肉桂酸降解酶的单位体积酶活由0.0036提高到0.0092 U·mL-1。
　　3.对肉桂酸降解酶的酶学性质进行了研究。结果表明:肉桂酸降解酶的最适温度为30℃，最适pH为7.0，在30-50℃的温度范围内，该酶保持较高的温度稳定性，酶在pH=6.0-7.5之间酶活性较稳定。对肉桂酸降解酶的催化动力学性质进行研究，得到肉桂酸降解酶的催化动力学参数为Km=0.07 g·L-1, Vmax=1.62μmol·L-1·min-1。
　　4.对JX13菌株产(S)-1-苯乙醇氧化酶的产酶发酵条件进行优化，主要从碳源、氮源、反应初始pH、发酵时间、瓶装量这五个因素进行单因素条件优化。最终得到最优的培养基以淀粉和酵母膏为碳源、氮源，初始pH为6.0，瓶装量为150mL装于500 mL锥形瓶，发酵时间为72 h。优化后，(S)-1-苯乙醇氧化酶的单位体积酶活由1.32×10-6提高到4.14×10-6 U·mL-1。
　　5.对(S)-1-苯乙醇氧化酶的酶学性质进行了研究。结果表明:酶的最适温度为35℃，最适pH为5.5，该酶在30-40℃时，有较高的热稳定性，pH在5.0-6.5的范围内该酶具有较高的稳定性。对(S)-1-苯乙醇氧化酶进行酶的催化动力学研究，得到该酶的催化动力学参数为Km=2.9 g·L-1，Vmax=0.0039μmol·L-1·min-1。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 概述

1．2 酶催化法

1．3 酶催化法合成天然香料的优点

1．4 手性化合物及其作用

1．5 酶催化法制备手性化合物

1．6 几种测定酶活的方法

1．6．1 比色法

1．6．2 量气法

1．6．3 滴定法

1．6．4 分光光度法

1．6．5 放射测量法

1．6．6 酶偶联法

1．6．7 高效液相色谱法

1．7 苯乙酮、肉桂酸及手性1-苯乙醇理化性质及其用途

1．7．1 苯乙酮、肉桂酸及手性1-苯乙醇理化性质

1．7．2 苯乙酮、肉桂酸及手性1-苯乙醇的用途

1．8 肉桂酸和苯乙酮分析方法研究进展

1．9 拆分1-苯乙醇分析方法研究进展

1．10 研究背景、意义及研究内容

1．10．1 立题的背景和意义

1．10．2 研究内容

第二章 Mucor sp．JX23产肉桂酸降解酶和JX13产(S)-1-苯乙醇氧化酶酶活测定方法的建立

2．1 引言

2．2 主要试剂和仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 仪器

2．3 蛋白质定量方法的建立

2．3．1 主要试剂的配制

2．3．2 检测波长的选择

2．3．3 标准曲线的绘制

2．4 Mucor sp．JX23产肉桂酸降解酶酶活测定方法的建立

2．4．1 实验方法

2．4．2 结果与讨论

2．5 (S)-1-苯乙醇氧化酶酶活测定方法的建立

2．5．1 实验方法

2．5．2 结果与讨论

2．6 本章小结

第三章 Mucor sp．JX23产肉桂酸降解酶发酵条件的优化

3．1 引言

3．2 试剂与仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 菌株来源

3．2．4 培养基的配制

3．2．5 营养液的配制

3．2．6 粗酶液的制取

3．2．7 粗酶液酶活的测定

3．2．8 数据处理方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 碳源对产酶的影响

3．3．2 氨源对产酶的影响

3．3．3 培养基初始pH对产酶的影响

3．3．4 发酵时间对产酶的影响

3．3．5 瓶装量对产酶的影响

3．3．6 单因素优化前后Mucor sp．JX23产肉桂酸降解酶情况的比较

3．4 本章小结

第四章 肉桂酸降解酶酶学性质研究

4．1 引言

4．2 实验试剂与仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 粗酶液的制取

4．3．2 粗酶液酶活的测定

4．3．3 酶的最适pH

4．3．4 酶的最适温度

4．3．5 酶的pH稳定性

4．3．6 酶的温度稳定性

4．3．7 肉桂酸降解酶的动力学性质研究

4．4 结果与讨论

4．4．1 肉桂酸降解酶的最适pH

4．4．2 肉桂酸降解酶的最适温度

4．4．3 肉桂酸降解酶的pH稳定性

4．4．4 肉桂酸降解酶的温度稳定性

4．4．5 肉桂酸降解酶的动力学性质研究

4．5 本章小结

第五章 JX13产(S)-1-苯乙醇氧化酶发酵条件的优化

5．1 引言

5．2 实验试剂与仪器

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验仪器

5．2．3 菌株来源

5．2．4 培养基的配制

5．2．5 粗酶液的制取

5．2．6 粗酶液酶活的测定

5．2．7 数据处理方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 碳源对产酶的影响

5．3．2 氮源对产酶的影响

5．3．3 培养基初始pH对产酶的影响

5．3．4 发酵时间对产酶的影响

5．3．5 瓶装量对产酶的影响

5．3．6 单因素优化前后JX13产(S)-1-苯乙醇氧化酶情况的比较

5．4 本章小结

第六章 (S)-1-苯乙醇氧化酶酶学性质研究

6．1 引言

6．2 实验试剂与仪器

6．2．1 实验试剂

6．2．2 实验仪器

6．3 实验方法

6．3．1 粗酶液酶活的测定

6．3．2 数据处理方法

6．3．3 酶的最适pH

6．3．4 酶的最适温度

6．3．5 酶的pH稳定性

6．3．6 酶的温度稳定性

6．3．7 (S)-1-苯乙醇氧化酶的动力学性质研究

6．4 结果与讨论

6．4．1 酶的最适pH

6．4．2 酶的最适温度

6．4．3 酶的pH稳定性

6．4．4 酶的温度稳定性

6．4．5 (S)-1-苯乙醇氧化酶的动力学性质研究

6．5 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文