猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp1α的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的一种传染病，该病的主要特征是母猪出现繁殖障碍以及仔猪出现严重的呼吸道症状。自1987年在美国首次发现以来，在全球主要养猪国家广泛流行。1996年郭宝清等从猪场流产胎儿分离出该病毒，证实了我国存在PRRS的流行。在此后的时间里，该病在国内大部分地区流行并在部分地区呈上升趋势，给我国养猪业造成了极大的经济损失。
　　PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。研究表明，该病毒感染机体后能够引起免疫抑制，形成持续性感染，具有抗体依赖性增强作用，并且病毒基因组遗传变异显著。病毒基因组编码的蛋白可划分为结构蛋白和非结构蛋白。非结构蛋白的功能主要作用在病毒RNA复制合成阶段并能够调控宿主对病毒的免疫反应过程。非结构蛋白1α(nsp1α)含有锌指结构域、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性区域、C-末端延伸区等区域，能够抑制Ⅰ-干扰素产生，在PRRSV逃逸机体免疫的过程中起到重要的作用。
　　本研究扩增出nsp1α基因片段，构建原核重组质粒，表达重组蛋白作为免疫原，免疫动物后获得多克隆抗体及单克隆抗体。实验内容主要包括:
　　1、PRRSV nsp1α原核表达及多克隆抗体的制备
　　以真核重组质粒pcDNA3.1-nsp1α为模板，扩增出nsp1α片段，构建原核表达质粒pET32a-nsp1α，转化到大肠杆菌BL21(DE3)并优化培养条件。在37℃条件下，1mM诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4h，菌液超声破碎后SDS-PAGE电泳表明重组蛋白以包涵体形式大量表达;大量诱导菌液并超声破碎，高速离心后得到包涵体，经过一系列缓冲液洗涤后用8M尿素缓冲液溶解包涵体，复性的包涵体作为免疫原免疫新西兰大白兔。免疫三次后，以包涵体复性液作为包被抗原，间接ELISA检测兔多克隆抗体血清，血清效价达到1∶2048000以上。
　　2、PRRSV nsp1α原核表达及单克隆抗体的制备
　　以真核重组质粒pcDNA3.1-nsp1α为模板，扩增出nsp1α片段，构建原核表达质粒pET28a-nsp1α，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃条件下，1mM诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h，SDS-PAGE蛋白电泳表明重组蛋白以包涵体形式大量表达，用8M尿素缓冲液溶解包涵体后，采用透析复性;复性的重组蛋白包被ELISA板，间接ELISA表明重组蛋白能够识别猪PRRSV阳性血清与阴性血清，具有较好的免疫学反应活性;重组蛋白免疫BALA/c小鼠，三次免疫后加强免疫一次，取小鼠脾脏细胞与SP2/0瘤细胞融合，以pET28a-nsp1α重组蛋白作为包被抗原，间接ELISA初次筛选阳性融合细胞，间接免疫荧光试验进一步筛选，最后得到稳定分泌nsp1α抗体的杂交瘤细胞;杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，一周后收集腹水，间接ELISA检测效价达到1∶512000。
　　上述制备的nsp1α多克隆抗体和单克隆抗体进行Western blot、间接免疫荧光及免疫组化实验，均能够特异性识别真核重组蛋白pcDNA3.1-nsp1α以及PRRSV BJ4株nsp1α天然蛋白。这为研制基于nsp1α检测的PRRSV诊断方法以及进一步研究nsp1α功能提供了研究基础。

目录

论文说明

声明

摘要

缩写词表

第一章 文献综述

1．1 PRRSV的分类及理化特性

1．2 PRRSV基因组结构

1．3 PRRSV基因组编码的蛋白及功能

1．3．1 病毒基因组编码的结构蛋白

1．3．2 病毒基因组编码的非结构蛋白

1．3．3 PRRSV nsp1α研究进展

1．4 PRRSV的致病机理

1．5 PRRS临床症状

1．6 PRRS流行病学

1．7 本研究的目的及意义

第二章 PRRSV nsp1α的原核表达及多克隆抗体制备

2．1 材料与试剂

2．1．1 毒株及质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 构建重组表达质粒pET32a-nsp1α

2．2．2 pET32a-nsp1α重组蛋白的表达及鉴定

2．2．3 pET32a-nsp1α重组蛋白的制备及包涵体的复性

2．2．4 免疫动物

2．2．5 多克隆抗体的特异性检测

2．3 结果

2．3．1 重组表达质粒pET32a-nsp1α构建结果

2．3．2 重组质粒pET32a-nsp1α蛋白表达

2．3．3 重组蛋白pET32a-nsp1α的变性及复性结果

2．3．4 兔多抗血清特异性鉴定结果

2．4 讨论

第三章 PRRSV nsp1α的原核表达及单克隆抗体的制备

3．1 材料与试剂

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要溶液的配制

3．2 实验方法

3．2．1 构建重组表达质粒pET28a-nsp1α

3．2．2 pET28a-nsp1α重组蛋白的表达及鉴定

3．2．3 pET28a-nsp1α重组蛋白的制备及包涵体的复性

3．2．4 动物免疫

3．2．5 间接ELISA检测阳性杂交瘤细胞方法的建立

3．2．6 PRRSV BJ株病毒的培养及TCID50的测定

3．2．7 杂交瘤细胞株的建立

3．2．8 杂交瘤细胞的筛选及腹水的制备

3．2．9 单克隆抗体的鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 pET28a-nsp1α重组质粒的构建

3．3．2 pET28a-nsp1α重组蛋白诱导表达及Western blot鉴定结果

3．3．3 pET28a-nsp1α重组蛋白的变性和复性结果

3．3．4 pET28a-nsp1α重组蛋白的活性分析

3．3．5 动物免疫结果

3．3．6 PRRSV BJ4株TCID50测定结果

3．3．7 阳性杂交瘤细胞的筛选

3．3．8 腹水效价

3．3．9 Western Blot鉴定结果

3．3．10 间接免疫荧光实验鉴定结果

3．3．11 免疫组化实验鉴定结果

3．4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间论文发表情况