木薯抗寒基因CBF1、CBF2的克隆和差异表达分析

摘要

本研究以木薯抗寒品种辐选01(RS01)和木薯不抗寒品种华南205(SC205)为试验材料，通过RT-PCR和巢式PCR技术，对木薯抗寒基因CBF1、CBF2分别进行克隆，同时运用荧光定量PCR技术和生物信息学方法，对其进行了基因差异表达以及功能分析，进而研究木薯不同品种的抗寒生理特性。主要研究结果如下:
　　1.根据同源CBF1基因的保守序列进行引物设计，运用RT-PCR和巢式PCR技术，首次在RS01和SC205中克隆出CBF1基因全长序列，总长度均为1000 bp，编码的氨基酸有238个，分子量为616.51kDa。通过序列比对，SC205仅编码129个氨基酸，导致其所表达的蛋白结构不完整，从而在面对低温胁迫时应答能力较差，是其不抗寒的原因之一。
　　2.通过生物信息学对木薯抗寒与不抗寒品种CBF1基因所表达氨基酸序列进行分析发现，RS01在第119个氨基酸位置表现出较强的疏水性，而SC205在第10个氨基酸位置表现较强。RS01中CBF1基因等电点为6.11，SC205等电点为4.36。对CBF1基因序列进行蛋白质二级及三级结构预测，发现目的基因与转录因子(PDB ID:3GCC)非常相似，由63个氨基酸以及一系列氨基酸结构组成。对于所克隆的CBF2基因进行蛋白质结构分析得到其含有HLH保守结构域，翻译出的螺旋-环-螺旋结构在功能上具有重要作用。
　　3.通过分析不同品种木薯与橡胶树、毛白杨的CBF1基因序列的进化树，比较得出木薯与橡胶树的同源性最高，达到84％，其次为毛白杨，其同源性则为60％。
　　4.通过对木薯CBF1基因进行实时荧光定量PCR检测，发现该基因在不同抗寒品种中表达量有差异，在5℃时差异最显著，RS01的表达量是SC205的4倍，验证了CBF1基因是与植物抗寒性相关的基因。
　　5.将木薯置于5℃、10℃、25℃下处理7天，对不同木薯品种进行抗寒性指标的测定，结果表明同一木薯品种在低温时脯氨酸和可溶性糖含量比常温处理高，且随温度成线性关系，温度越低含量越高。而MDA则在SC205中表现出先升高后降低的趋势。SOD、CAT活性在RS01中高于SC205，且差异显著。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 木薯概述

1．2 植物的抗寒性

1．2．1 细胞膜系统与抗寒性

1．2．2 抗氧化系统与抗寒性

1．2．3 渗透调节物质与抗寒性

1．3 抗寒性相关基因的研究

1．3．1 LEA蛋白基因的研究

1．3．2 冷调节基因的研究

1．3．3 基因表达转录水平的研究

1．4 木薯抗寒性研究进展

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验仪器与试剂

2．2．1 仪器

2．2．2 试剂

2．3 基因克隆相关试验方法

2．3．1 木薯总RNA的提取

2．3．2 总RNA的浓度测定及电泳分析

2．3．3 总RNA逆转录合成cDNA

2．3．4 CBF1和CBF2基因的克隆

2．3．5 目的基因片段的回收

2．3．6 目的基因片段的转化

2．3．7 质粒DNA的提取

2．3．8 CBF1基因的双酶切

2．3．9 酶切后的CBF1基因与PBI121-GFP载体质粒的连接

2．4 目的基因的实时荧光定量

2．4．1 RNA反转录生成cDNA第一条链

2．4．2 实时荧光定量PCR

3 结果与分析

3．1 木著总RNA及cDNA的质量分析

3．2 木薯CBF1基因的克隆及双酶切

3．3 CBF1基因在不同木薯品种中的差异分析

3．4 CBF1基因所表达的蛋白结构分析

3．5 CBF1基因的实时荧光定量分析

3．6 木薯CBF2基因的克隆及蛋白分析

3．7 抗寒相关生理指标的研究

3．7．1 脯氨酸

3．7．2 可溶性糖

3．7．3 SOD活性

3．7．4 CAT活性

3．7．5 丙二醛

3．8 木薯抗寒基因功能的初步分析

4 讨论

4．1 CBF1及CBF2基因的克隆

4．2 木薯抗寒性不同品种CBF1及CBF2基因的差异表达

4．3 木薯抗寒基因CBF1及CBF2的蛋白结构

4．4 木薯抗寒生理特性

5 结论

6 创新点

7 问题与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况