东农冬麦1号抗寒性鉴定及CBF2基因克隆和表达分析

摘要

适应高寒地区种植的冬小麦品种，其抗寒水平是最主要的适应性状之一。在培育强抗寒冬小麦品种的过程中，其变异材料的抗寒水平准确鉴定为其育种进展的最关键环节之一。以往主要以田间自然越冬后的返青率为鉴定标准，但由于自然条件年际之间的不稳定性，常使育种材料的抗寒鉴定结果出现较大偏差。目前，衡量冬小麦抗寒水平的通用方法是由逐渐降温后分阶段测定材料组织的相对电导率，模拟测定出其半致死温度(即LT50)。但这种方法也常与品种实际的抗寒水平差距较大。研发冬小麦育种材料抗寒水平鉴定的技术是冬小麦抗寒育种必须解决的主要问题。而冬小麦的抗寒遗传基础研究则是抗寒育种的另一主要方面，为其抗寒水平的遗传改良提供基础。
　　 本研究利用模拟冷冻处理评价冬小麦品种的抗寒性。以本实验室于2007年通过审定并命名为东农冬麦1号的高抗寒品种和不抗寒品种济麦22为材料，以不同的冷冻条件鉴定品种抗寒性的水平，以期确定鉴定冬小麦品种最大抗寒力的冷冻程序。通过调查返青率和测定电导率的方法评价东农冬麦1号的抗寒性，并比较对两个品种的抗寒性进行比较；大量的实验研究表明，高抗寒植物品种之所以有较强的抗寒能力，通过CBF转录因子冷适应途径起着一定的作用，因此本研究还将利用高抗寒品种东农冬麦1号克隆CBF家族及其相关基因，分别是CBF2(AY951945)、CBF4(AY951945)、CBF5(AY785902.1)、CBF9(AY785905.1)、CBF14(AY785901.1)、ICE41(EU562183.1)、ICE87(EU562184.1)进行克隆，并对克隆出的序列进行验证，然后进一步利用实时荧光定量PCR技术对通过验证的基因进行定量分析，从而了解在高抗寒品种东农冬麦1号中CBF基因的表达情况。以上研究结果分别为：
　　 1)-12℃的低温处理东农冬麦1号24h以内其返青率均在70％以上。
　　 2)通过对小麦叶片和叶鞘电导率的测定，我们发现在遭受冷害后叶片的电导率总是高于鞘，即叶片的受伤害程度总是高于叶鞘；叶片的受伤害程度与小麦的返青率相关性不大，但是叶鞘是决定小麦返青率高低的重要部位。通过拟合Logistic方程求出东农冬麦1号叶鞘的半致死温度为-19.55℃。
　　 3)采用本试验所设计的模拟冷冻条件可以准确地鉴定冬小麦幼苗抗寒潜力。其抗寒鉴定的苗龄应达3～5叶，冷冻试验应采用程序G。东农冬麦1号经程序G处理后，其半致死温度(LT50)为-33℃；济麦22的LT50为-16℃。
　　 4)在东农冬麦1号中克隆得到的序列C2、C4、C5、C9、C14、I41和I87。结果显示，序列C2为CBF家族成员中的CBF2；C4、I41和I87序列分别确定是普通小麦3B染色体上的部分序列。序列C5与二粒小麦部分序列相似度达97%。序列C14与普通小麦Triticum aestivum cloneBAC1031P08相似度达100%。
　　 5)经冷冻处理后，东农冬麦1号中克隆得到的多个序列，其中之一为CBF2基因的片段，其长度为482bp，存在AP2/EREBP结构域和2段保守序列。该片段与一粒小麦的COR/DREbindg fartor2(AY951945.1)、黑麦的CBFIVa-2B(ABY59787.1)和大麦的CBF2(ABE02653.1)相似度为100%、99%和100%。
　　 6)东农冬麦1号叶片中CBF2在4℃处理4h开始明显表达，6h时达到峰值，12h后最低；0℃作用2h，CBF2表达量最高，其他处理其表达量变化不大，而在3℃处理2h后温度升至室温后，其表达量略有升高；CBF2在东农冬麦1号叶鞘中4℃10min时表达量最大，随着时间的延长表达量整体呈下降趋势。
　　 7)东农冬麦1号CBF2序列翻译所对应的蛋白序列的N端40-60区域氨基酸表现为较强烈的疏水性。其他克隆序列与相应的目的序列相差较大，但是多数为小麦3B染色体上的一段序列，说明冷驯化初期小麦的3B染色体活化。