苹果属种质资源抗寒性鉴定及抗寒基因FAD2和GPAT的克隆和表达分析

摘要

本试验以44种苹果砧木的一年生休眠枝条为试材，进行0℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃人工低温冷冻处理，应用电导率法测定供试枝条在不同低温下细胞膜透性的变化，采用方程拟合求得半致死温度，对44种苹果砧木抗寒性的强弱进行比较。分别以山定子和嘎拉为试材，克隆得到油酸去饱和酶基因MbFAD2和甘油-3-磷酸酰基转移酶基因MdGPAT，并对这两个基因进行生物信息学分析和表达分析。试验研究结果如下: 1.供试44种苹果砧木随着温度的降低砧木枝条的相对电导率逐渐升高，通过方程拟合求出半致死温度，半致死温度最低的为山定子，最高的为沧江海棠，分别为-45.7624℃、-26.5283℃。将所测砧木抗寒性分为5个等级，分别为抗寒性强、抗寒性较强、抗寒性中、抗寒性较弱、抗寒性弱。 2.采用RT-PCR技术，首次从山定子中克隆到油酸去饱和酸酶基因，该基因命名为MbFAD2。其最大开放阅读框为1149bp，编码个382个氨基酸，在GenBank的登陆号为KC702671。在NCBI上经过BLASTp比对分析发现该基因属于FADS-like家族。经过DNAMAN6.0软件分析的出该基因有三个高度保守的组氨酸簇，分别为HECGHH(HisⅠ区)、HRRHH(HisⅡ区)和HVAHH(HisⅢ区)。二级结构分析表明，MbFAD2蛋白分子中，α-螺旋、随机卷曲和不规则卷曲分别为35.86％、16.23％、47.91％，系统进化树关系分析表明，MbFAD2与橡胶树和毛白杨的亲缘关系最近，共同形成一个分支，亲源关系最远的为玉米和中间锦鸡儿。MbFAD2进行蛋白跨膜区分析发现该蛋白具有六个跨膜区域。 3.采用RT-PCR技术，首次从嘎拉叶片的cDNA中克隆得到甘油三磷酸酰基转移酶基因，该基因命名为MdGPAT。其最大开放阅读框为1365bp，编码个454个氨基酸，在GenBank的登陆号为KC693008。在NCBI上经过BLASTp比对分析发现该基因属于LPLAT基因超级家族。经过DNAMAN6.0软件分析的该基因的氨基酸序列具有wiapsggrdrp的保守区域。二级结构分析表明，MdGPAT蛋白分子中，扩展链、α-螺旋结构和无规则卷曲分别占50.44％、39.43％、10.13％。系统进化树关系分析表明，MdGPAT与南瓜的亲缘关系最近，共同形成一个分支，亲源关系最远的为番茄和玉米。MdGPAT进行蛋白跨膜区分析发现该蛋白不具有跨膜区域。 4.通过实时荧光定量表达研究表明，MbFAD2在山定子中的根、茎、叶和花中均有表达，其中在花中的表达量最高，其次是叶片。在4℃低温胁迫处理植株的过程中，MbFAD2在叶片中的表达量随着处理时间的增加表现为先升高后下降的趋势，其中24h时该基因表达量最高，48h后该基因表达量下降;该基因茎中的表达情况与叶中的表达情况不同，茎中该基因的表达是随着处理时间的增加表达量逐渐升高。在0h-24h中，该基因在山定子叶中的表达量比茎中的表达量高，而在48h-72h中，茎中该基因的表达量比叶中的高。本试验说明该基因的表达量与低温有关，该基因在叶中表达较茎敏感，而在茎中短时间内不表达。通过实时荧光定量表达研究表明，MdGPAT在嘎拉叶片中的表达量最高，其次是茎，根和花中几乎不表达。4℃低温胁迫处理嘎拉生根组培苗，该基因在叶片中快速表达。整个胁迫处理过程中MdGPAT的表达量随着处理时间的增加表现为先升高后下降的总体趋势，其中8h时该基因表达量迅速升高，16h后该基因表达量下降。本试验说明MbFAD2和MdGPAT的与低温逆境有关。

目录

声明

摘要

前言

文献综述

1 果树抗寒性研究进展

1．1 植物抗寒性与组织形态变化及细胞器的研究

1．2 果树抗寒性生理代谢的研究

1．3 分子生物学与抗寒性

2 果树抗寒性的鉴定方法

2．1 田间调查鉴定抗寒性

2．2 室内鉴定

第一章 苹果属砧木资源抗寒性初步测定

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 试验仪器

1．4 试验方法

2 结果与分析

2．1 不同低温胁迫下苹果砧木枝条相对电导率

2．2 不同低温胁迫下苹果砧木枝条相对电导率的变化趋势

2．3 苹果砧木电解质渗出率与温度的回归方程及半致死温度

2．4 抗寒性等级的分类

3 小结和讨论

第二章 抗寒基因的克隆及序列分析

1 山定子FAD2基因的克隆及序列分析

1．1 材料及方法

1．2 试验方法

1．3 结果与分析

2 苹果GPAT基因的克隆及序列和序列分析

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．3 结果与分析

3 讨论和小结

第三章 利用Real-time PCR技术进行抗寒基因的表达分析

1 利用Real-time PCR对MbFAD2进行表达分析

1．1 试验材料及方法

1．2 试验方法

1．3 结果分析

2．利用Real-time PCR对进行表达分析

2．1 材料及其处理

2．2 试验方法

2．3 结果分析

3 讨论和小结

参考文献

缩略词

致谢