猪繁殖与呼吸综合征病毒在ORF7和3’UTR之间插入外源基因的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种猪繁殖障碍和呼吸系统的高度接触性传染病。我国于1996年首次报道此病并分离出病毒，随后该病在我国广泛传播。用于防控PRRSV的传统疫苗不能区分野毒，灭活苗保护率低下，而弱毒苗存在可能毒力返强和毒株间交叉保护性差等问题。因此开发PRRSV标记疫苗和利用PRRSV基因组作为病毒载体的重组活载体疫苗研究成为了当今PRRS疫苗的研究热点方向之一。
　　本研究采用PCR的方法在PRRSV毒株vJX25HB全长cDNA克隆载体pAJX25HB的基础上，在其ORF7和3'UTR之间插入BstBⅠ、SbfⅠ酶切位点和转录调控序列TRS，构建获得了pAJX25HB-73BS-TRS表达载体。之后将外源基因EGFP(green fluorescent protein)、PRRSV-ORF4、EAV(equine arteritis virus,EAV)-ORF4、EAV-ORF5a插入该载体BstBⅠ酶切位点和SbfⅠ酶切位点之间，获得了以下重组质粒:pAJX25HB-73BS-TRS-EGFP、pAJX25HB-73BS-TRS-PRRSV-ORF4、pAJX25HB-73BS-TRS-EAV-ORF4、pAJX25HB-73BS-TRS-EAV-ORF5a。将所有的重组质粒分别转染BHK-21细胞获得包装好的病毒粒子，再转接到MARC-145细胞上进行病毒拯救。结果表明，重组的病毒能够在MARC-145细胞中产生典型的CPE(cytopathic effect)。RT-PCR和IFA分析也能检测到病毒的基因组和PRRSV特异的N蛋白的表达。重组病毒传至第3代，RT-PCR扩增、酶切和测序结果显示重组的PRRS病毒都含有特征性分子标记（人工PCR突变插入的限制性内切酶SbfⅠ酶切位点）和插入的外源基因序列;多步生长曲线实验结果表明，所有拯救的重组病毒在MARC-145细胞上的增殖特性与亲本病毒相似，病毒的滴度在第36h时达到最高值，并且前48h的病毒增殖速度明显高于亲本病毒vJX25HB，rJX25HB-73BS-TRS-PRRSV-ORF4在60h之后其病毒滴度始终最低，rJX25HB-73BS-TRS-EGFP的初始病毒滴度最低，可能是与其插入的外源碱基数量最大有关。另外，作为同为插入EAV的外源基因毒株rJX25HB-73BS-TRS-EAV-ORF4和rJX25HB-73BS-TRS-EAV-ORF5a，除起始时滴度不一样以外，其余时间点病毒滴度几乎保持一致。
　　本实验为PRRS病毒在其ORF7和3'UTR之间插入外源基因进行了前期的基础性研究。因此，此研究为以PRRSV为载体的重组疫苗的研究奠定了重要基础。

目录

声明

摘要

1．1 PRRSV简介

1．2 HP-PRRSV

1．3 危害

1．4 理化特性和生物学特性

1．4．1 理化特性

1．4．2 生物学特性

1．5 基因组结构

1．6 病毒基因的复制与转录

1．7 结构蛋白与非结构蛋白的功能与特性

1．7．1 非结构蛋白

1．7．2 结构蛋白

1．8 PRRSV疫苗

1．8．1 灭活苗

1．8．2 弱毒苗

1．8．3 新型疫苗(亚单位疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗)

1．9 生物安全措施

1．9．1 猪场外部生物安全措施

1．9．2 猪场内部生物安全措施

1．9．3 其他生物安全措施

1．10 本研究的目的和意义

1．11 本研究的实验技术路线

第二章 在ORF7和3’UTR之间表达外源基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建、拯救及外源基因的表达

2．1 材料

2．1．2 主要试剂耗材

2．1．3 相关试剂的配置

2．1．4 细胞

2．1．5 质粒

2．1．6 引物设计与合成

2．1．7 分子生物学相关软件

2．2 方法

2．2．1 重组PRRSV感染性克隆的构建

2．2．2 重组PRRSV感染性克隆拯救、传代

2．2．3 重组拯救病毒的CPE

2．2．4 重组拯救病毒的P3代TCID50

2．2．5 重组拯救病毒的遗传稳定性

2．2．6 重组拯救病毒的间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay，IFA)

2．2．7 重组拯救病毒的多步生长曲线试验

2．3 结果

2．3．1 重组PRRSV感染性克隆的构建

2．3．2 重组PRRSV感染性克隆拯救

2．3．3 重组拯救病毒的CPE

2．3．4 重组拯救病毒的P3代TCID50

2．3．5 重组拯救病毒的遗传稳定性

2．3．7 重组拯救病毒的多步生长曲线试验

2．4 讨论

结论

参考文献

致谢

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