水牛卵丘细胞主要能量供给途径及葡萄糖对其生长特性影响的初探

摘要

葡萄糖是动物体内重要的营养物质，直接或间接参与动物体的新陈代谢过程。研究表明葡萄糖是哺乳动物卵泡发育、卵母细胞成熟和胚胎发育的重要能量来源，并且参与了卵丘扩展、卵母细胞成熟以及早期胚胎发育的分子调控过程。本研究首先探讨水牛卵丘细胞能量供给的主要途径，在此基础上，初步探讨葡萄糖对水牛卵丘细胞生长特性的影响，以期为进一步优化卵丘细胞培养条件，改善卵母细胞体外成熟培养体系奠定基础。首先在体外培养的第二代水牛卵丘细胞的培养液中分别加入氧化磷酸化途径抑制剂、磷酸戊糖途径抑制剂以及糖酵解途径抑制剂，观察细胞的生长状态，并利用ATP生物荧光法检测葡萄糖代谢中相关途径被抑制后细胞的产能变化情况。结果显示:氧化磷酸化途径被抑制后，水牛卵丘细胞生长状态正常，细胞产能变化不显著(P＞0.05)。磷酸戊糖途径被抑制后，水牛卵丘细胞产能减少，但细胞依然维持正常的生长状态。糖酵解途径被抑制后，水牛卵丘细胞的生长状态会受不同程度的影响，细胞产能与其糖酵解途径受抑制程度呈现出梯度变化。糖酵解途径和磷酸戊糖途径被抑制后，细胞的产能均显著减少(P＜0.05)，但糖酵解途径被抑制后细胞产能减少的程度高于磷酸戊糖途径产能减少的程度(61.46％vs24.7％)。其次，分别利用不同浓度葡萄糖（0g/L、1g/L、4.5g/L和9g/L）处理水牛卵丘细胞48h，探讨葡萄糖对水牛卵丘细胞生长特性的影响，包括细胞生长趋势、细胞倍增时间、细胞增殖水平、细胞凋亡情况和细胞对葡萄糖的利用率等。结果显示:不同浓度葡萄糖作用下水牛卵丘细胞形态无明显区别，细胞生长曲线均呈现“S”型。但细胞培养液中不含葡萄糖，水牛卵丘细胞生长趋势相对缓慢，增殖能力较弱。1g/L和4.5g/L浓度葡萄糖处理组细胞生长趋势相似，与对照组相比，两组细胞倍增时间缩短，细胞增殖能力极显著提高(P＜0.01)，以及细胞凋亡率显著下降(P＜0.05)，但4.5g/L处理组的水牛卵丘细胞对葡萄糖利用率极显著高于1g/L处理组(P＜0.01)。细胞培养液中添加9g/L葡萄糖，在一定时间内有刺激卵丘细胞增殖的效应，但随作用时间延长此效应消失，并出现抑制细胞增殖的现象。利用荧光定量PCR检测水牛卵丘细胞糖酵解相关基因mRNA表达情况，结果发现:4.5g/L处理组细胞糖酵解相关基因HK、PFK和LDH的mRNA表达量均显著高于0g/L、1g/L和9g/L处理组。上述结果表明:(1)糖酵解途径和磷酸戊糖途径是体外培养水牛卵丘细胞的主要能量供给途径，其中糖酵解途径的产能作用更为突出，而水牛卵丘细胞极少利用氧化磷酸化途径产能;(2)适宜葡萄糖浓度(4.5g/L)可促进水牛卵丘细胞增殖，减少细胞凋亡，且有利于上调糖酵解相关基因HK、PFK和LDH的表达，从而提高细胞糖酵解，促进卵丘细胞对葡萄糖的利用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中的作用

1．2 卵丘细胞支持卵母细胞胞质成熟

1．3 卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系

1．4 卵丘细胞对卵母细胞受精与发育能力的影响

2 卵母细胞与卵丘细胞葡萄糖代谢的过程及作用

2．1 糖酵解途径在卵母细胞代谢中的作用

2．2 氧化磷酸化途径在卵母细胞代谢中的作用

2．3 磷酸戊糖途径在卵母细胞代谢中的作用

2．4 己糖胺生物合成途径在卵母细胞代谢中的作用

2．5 多元醇途径在卵母细胞能量代谢中的作用

3 葡萄糖浓度对雌性生殖细胞的影响

3．1 高糖对卵母细胞产生的影响

3．2 低糖对卵母细胞产生的影响

3．3 高糖、低糖对卵丘细胞的影响

4 研究目的和意义

第二章 水牛卵丘细胞主要能量供给途径的研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 试验设计

1．4 数据处理分析

2 结果

2．1 抑制糖酵解途径对水牛卵丘细胞生长状态及产能的影响

2．2 抑制磷酸戊糖途径对水牛卵丘细胞生长状态及产能的影响

2．3 抑制氧化磷酸化途径对水牛卵丘细胞生长状态及产能的影响

3 分析与讨论

4 小结

第三章 葡萄糖对水牛卵丘细胞生长特性的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 试验设计

1．4 统计分析

2 结果

2．1 不同浓度葡萄糖对水牛卵丘细胞生长的影响

2．2 不同浓度葡萄糖对水牛卵丘细胞增殖水平的影响

2．3 不同浓度葡萄糖对水牛卵丘细胞凋亡的影响

2．4 不同浓度葡萄糖对水牛卵丘细胞的葡萄糖吸收的影响

2．5 不同浓度葡萄糖对水牛卵丘细胞糖酵解途径中相关基因表达量的影响

3 分析与讨论

4 小结

全文结论

参考文献

中英文缩略

致谢