异形香菇子实体的病因探索

摘要

香菇是中国生产最多的食用菌种类。香菇不仅有药用价值，还营养丰富，味道极好。香菇的生长和子实体形成受生物、化学和物理等许多因素影响。病毒感染也也是影响香菇正常生长的主要因素之一。一些病毒感染香菇可引起严重的子实体异形症状，一些病毒感染则不造成任何畸形或代谢变化。生产上常见的异形香菇子实体是否由病毒侵染引起尚不明确。本文通过采集市场上出现的异形香菇，检测子实体中是否含有病毒，同时，通过人工培养及诱发香菇子实体，观察是否产生异形子实体，来探讨引起异形子实体的病因。
　　首先，下载和比对NCBI(National Centre for Biotechnology Information)上登录的香菇病毒的RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)基因的序列，设计4对引物，对异形香菇子实体的总RNA进行RT-PCR，仅一对引物能扩增到一段模糊的约400 bp的片段，对所获片段进行回收、转化、测序及BLAST比对，发现所获序列与人类的哺乳动物腺病毒C株系(Human Mastadenovirus C strain)有80％的同源性，未发现已报道的寄生香菇的病毒。
　　其次，通过小RNA深度测序技术，检测不同类型的异形香菇子实体混合样中是否存在病毒。在检测总RNA合格的情况下送专业公司检测测序。测序结果表明，获得2435，4892个原始reads，共有2290，4100个质量好的reads，占94.04％;长度18-26 nt的sRNA片段数量为1000，1252个，mapped sRNA的数量是14，2360个片段，mappedsRNA仅占1.42％。分析数据表明，与西枞色卷蛾颗粒体病毒（Choristoneuraoecidentalis granulovirus）同源的片段占总的mapped RNA片段的17.41％，占总的sRNA片段的0.25％是最有可能来源于待测sRNA数据库的病毒。未发现与已报道的香菇病毒同源的mapped sRNA片段。
　　第三，分离和纯化不同类型的异形香菇样品，比较菌丝生长速度。结果发现，不同样品的香菇菌丝体，在PDA培养基上生长速度不同，个别样品生长速度较快，在第9d菌落直径达到8.0 cm以上的只有4个样品，包括W4-2和W4-7（菌落直径8.18cm),W5-1和W5-3(菌落直径8.5 cm);菌落直径不达到5 cm的有5个样品包括W1-3、W1-3、W2-5、W3-2、W3-8和W3-9;其他样品的菌落直径在6.45-7.55cm之间。生长速度快的样品属于菌盖顶呈锥形和菌盖边缘有缺刻的异形类型，生长速度慢的有5个样品，其中3个样品(W3-2、W3-8和W3-9)属于多头子实体的异形类型，1个样品(W1-3)菌盖顶呈锥形类型，1个样品(W2-5)属于菌盖边缘有缺刻类型，其他异形类型的样品生长速度中等快。
　　诱发出菇的结果表明，W2-3样品产生的子实体最多，84.82g/袋，生物效率13.05％。W5-1样品产生的子实体是最少，只有1.32g/袋，生物效率0.2％。21个样品中12个样品产生子实体。除了样品W2-3、W5-1、W5-3外都产生了正常的形态，样品W6-1由于子实体不能正常伸出塑料袋，所以产生异常的子实体。由于采集的样品经人工培养后可产生正常的子实体，因此认为，产生异形子实体的原因可能和培养过程的物理因素有关，如人工培养的环境控制不好、温度偏高、湿度不稳定、培养料装袋过紧使子实体不能正常出菇等，这些因素都可能引起出菇异常。生产上要控制好人工培养的条件，找出易引起出菇异常的因子，减少异形出菇率，提高产量和生物效率。

目录

声明

摘要

1．1 寄生真菌的病毒

1．2 寄生食用菌的病毒

1．3 食用菌病毒感染的症状特点

1．4 食用菌病毒的类型

1．4．1 感染平菇(Pleurotus sp．)的病毒

1．4．2 感染香菇(Lentinula edodes)的病毒

1．4．4 感染金针菇(Flammulina velutipes)的病毒

1．5 食用菌病毒的传播

1．5．1 横向传播

1．5．2 垂直传播

1．6 食用菌病毒检测技术

1．6．1 电子显微镜

1．6．2 分子技术

1．6．3 血清学检测技术

1．7 使用基于RNAi的高通量测序开发病毒识别方法

1．8 选题的研究意义与目的

2．1 材料

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基配置制

2．1．3 所用的需试剂

2．1．4 主要仪器设备及用具

2．2 方法

2．2．1 总RNA提取

2．2．2 小RNA深度测序与序列分析

2．2．3 cDNA合成(反转录反应)

2．2．4 引物设计与合成

2．2．5 PCR反应

2．2．6 电泳

2．2．7 PCR产物的回收纯化

2．2．8 连接

2．2．9 转化反应

2．2．10 菌落PCR鉴定

2．2．11 提取质粒

2．2．12 序列测定与分析

2．2．13 菌丝生长速度比较

2．2．14 香菇人工培养

3．1 异形香菇的形态特征及其类型

3．2 香菇的总RNA提取

3．3 小RNA深度测序与序列分析

3．4 香菇病毒基因组RdRP基因的克隆与测序

3．5 异形香菇子实体的纯化和菌丝生长速度比较

3．6 香菇人工培养

4．讨论与结论

4．1 讨论

4．1．1 深度小RNA测序

4．1．2 分子遗传学方法

4．1．3 畸形香菇子实体的纯化和菌丝生长速度比较

4．2 结论

参考文献

致谢