蛇副粘病毒Ferlavirus的体外培养研究

摘要

Ferlavirus(FDLV)是引起蛇类呼吸道感染的常见重要病原之一，也是广西人工养殖蛇类的常见疾病之一，临床表现典型的肺炎症状。在本研究中，首先从临床病例中鉴定FDLV，其次筛选适合培养FDLV的细胞系，然后进行培养液的改良和Vero细胞的无血清驯化，第四进行Ferlavirus的保存试验，第五设计分段引物进行Ferlavirus的基因测序，最后建立实时荧光定量PCR方法检测Ferlavirus。
　　首先本研究首先运用RT-PCR方法检测临床送检的肺炎蛇肺脏和肝脏，将检出的Ferlavirus阳性病料于-80℃低温保存，用于病毒的分离培养。
　　其次进行细胞系的筛选。在不同的细胞内接种同样剂量的10％的阳性病料处理液，培养24h后每隔4h观察细胞的形态，同时用红细胞凝集(HA)试验测定血凝值。
　　再次进行培养液的改良和Vero细胞的无血清驯化。选用Earle液为基础培养基，逐步降低血清，同时添加水解乳蛋白、谷氨酰胺等添加因子，Vero细胞生长状态良好，数量倍增明显。Ferlavirus接种到无血清培养的Vero细胞中，细胞病变主要表现为产生合胞体，即多核巨细胞，胞浆呈颗粒样变化，胞膜边缘不整齐甚至模糊不清。取培养后的细胞进行HA试验和RT-PCR检测。
　　第四，进行Ferlavirus的保存试验。Ferlavirus在环境中容易失去活性，为了获取Ferlavirus的保存方法，进行了血球凝集实验、温度敏感试验、有机溶剂敏感试验、酸性溶液敏感试验。
　　第五，Ferlavirus的基因测序。采用分段设计引物的方式，针对Ferlavirus设计片段为1500-2000bp的测序引物，用降落PCR、梯度PCR等优化策略，优化PCR反应条件。通过建立重组质粒，将得到的基因片段插入质粒中，送检测序，使用DNAman软件将得到的基因片段拼装组合。
　　最后建立实时荧光定量PCR方法检测Ferlavirus。针对Ferlavirus病毒的保守区L基因设计相应引物，建立Real Time PCR方法，并对Real Time PCR反应条件的优化、绘制出SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线、并对其特异性、重复性进行分析。结果表明:标准曲线的线性度较好，PCR的扩增效率也比较好，而待测样品的Ct值可以从仪器读取;将不同稀释度的标准品Ferlavirus分别进行PCR扩增，用统计学软件分析表明，所建立的Real-time PCR在组间和组内都具有良好的重复性(P＞0.05)，相关系数均大于0.99。
　　从以上实验得出结论:(1)Ferlavirus能在传代细胞系BHK细胞和Vero细胞生长，不能在Marc-145细胞和PK细胞生长。(2)Ferlavirus在无血清改良培养基的Vero细胞中，传代5次，培养36小时后可观察到明显细胞病变，血凝效价大于或者等于1∶27，即1∶128时，红细胞凝集(HA)试验和RT-PCR检测均为阳性。(3)初始血凝效价HA为1∶28的Ferlavirus病毒培养液在-80℃仅能贮存35天，加入冷冻保护剂且调节pH为中性或弱酸性后可延长贮存期到65天。(4)设计测序引物，测序并拼接后得到Ferlavirus的基因片段6458bp。(5)成功建立了Ferlavirus的荧光定量PCR检测方法，该方法特异性强，重复性好，灵敏度高，最低可检测到10copies/μl。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 蛇副黏病毒的研究进展

1．1．2 Ferlavirus基因组编码蛋白的特性

1．1．3 Ferlavirus的分离鉴定

1．2 病毒体外培养研究进展

1．2．1 转瓶培养

1．2．2 多层平板培养系统

1．2．3 生物反应器培养

1．2．4 病毒无血清培养

1．2．5 微载体培养

1．3 Ferlavirus的诊断方法

1．3．1 血清学方法

1．3．2 分子生物学诊断技术研究进展

1．4 研究目的与意义

第二章 Ferlavirus阳性病例的检测

2．1实 验材料

2．1．1 实验样品

2．1．2 实验试剂及其配制

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 实验样品准备

2．2．4 聚合酶链式反应(PCR)

2．2．5 琼脂糖凝胶电泳

2．3 实验结果

2．4 分析和讨论

第三章 Ferlavirus在Vero细胞中的培养

3．1 实验材料

3．1．1 实验细胞

3．1．2 实验样品

3．1．3 实验试剂

3．1．4 实验仪器

3．1．5 培养基的配制

3．2 实验方法

3．2．1 Vero细胞的复苏

3．2．2 Vero细胞的传代

3．2．4 用MTT比色法检测Vero细胞无血清驯化的结果

3．2．5 Ferlavirus在Vero细胞中的适应

3．2．6 通过红细胞凝集试验(HA试验)初步检测病毒

3．2．7 病毒RNA的抽提

3．2．8 反转录(RT)

3．2．9 链式聚合酶反应(PCR)

3．2．10 凝胶电泳检测

3．3 实验结果

3．3．1 Vero细胞的复苏和传代

3．3．2 Vero细胞的无血清驯化培养

3．3．2 无血清状态下FerLavirus在Vero细胞中的适应生长

3．3．3 细胞培养产物中Ferlavirus的检测

3．4 分析和讨论

第四章 Ferlavirus保存方法的研究

4．1 实验材料

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂及其配制

4．1．3 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 实验样品准备

4．2．2 血球凝集(HA)试验

4．2．3 温度敏感性试验

4．2．4 有机溶剂敏感性试验

4，2．5 酸性溶液敏感性试验

4．3 实验结果

4．3．1 血球凝集(HA)试验

4．3．2 温度敏感性试验

4．3．3 有机溶剂敏感性试验

4．3．4 酸性溶液敏感性试验

4．4 分析和讨论

第五章 Ferlavirus的分段测序

5．1 实验材料

5．1．1 实验样品

5．1．2 实验试剂

5．1．3 实验仪器

5．1．4 培养基配制

5．2 实验方法

5．2．3 反转录(RT)

5．2．4 链式聚合酶反应(PCR)

5．2．5 电泳分析

5．2．6 PCR产物回收

5．2．8 目的基因连接

5．2．9 转化

5．2．10 重组质粒的PCR鉴定

5．3 试验结果

5．3．3 测序及拼接结果

第六章 实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

6．1 实验材料

6．1．1 实验样品

6．1．2 实验试剂

6．1．3 实验仪器

6．1．4 培养基配制

6．2 实验方法

6．2．4 链式聚合酶反应(PCR)

6．2．5 电泳分析

6．2．6 PCR产物回收

6．2．8 目的基因连接

6，2．9 转化

6．2．13 实时荧光定量PCR反应条件的初步探索

6．2．14 实时荧光定量PCR的标曲建立

6．2．15 荧光定量PCR检测方法的建立

6．2．16 特异性试验

6．2，17 敏感性试验

6．2．18 重复性和稳定性试验

6．3 试验结果

6．3．1 目的基因片段PCR扩增

6．3．2 重组质粒的鉴定

6．3．3 标准品的制备及拷贝数测定

6．3．4 荧光定量PCR检测方法的建立

6．3．5 特异性试验

6．3．6 敏感性试验

6．3．7 重复性和稳定性试验

第七章 结论

参考文献

附录

致谢