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鹿衔草水提物对粪肠球菌抑制作用及抑菌机理的研究

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摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1.1 鹿衔草概述

1.1.1 鹿衔草化学成分

1.1.2 鹿衔草药理作用

1.2 粪肠球菌

1.2.1 生理学特性

1.2.2 致病性

1.2.3 毒力因子

1.2.4 检测方法

1.3 牙根管炎的研究进展

1.3.1 感染根管的发生机制

1.3.2 感染根管的分类以及微生物组成

1.3.3 感染根管内的细菌定植状态

1.3.4 感染根管的治疗

1.3.5 根管治疗难点

第二章 细菌分离与鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 仪器

2.1.3 试剂和药品

2.2 实验方法

2.2.1 菌种的分离与鉴定

2.2.2 形态学观察

2.2.3 16sRNA一代测序

2.2.4 抗菌药的制备与抑菌浓度测定

2.3 结果

2.3.1 细菌的分离鉴定

2.3.2 形态学观察

2.4.3 测序结果

2.4.4 对常见抗生素的敏感性实验

2.4 讨论与小结

第三章 中药抑菌效果实验

3.1 实验材料

3.1.1 仪器

3.1.2 试剂

3.1.3 药品

3.2 试验方法

3.2.1 中药水提物制备

3.2.2 中药最小抑菌浓度

3.2.3 鹿衔草水提物与西药联合抑制效果

3.2.4 药物联合作用效果的评价

3.3 结果

3.3.1 中药最小抑菌浓度结果

3.3.2 鹿衔草水提物与西药的联合药敏结果

3.4 讨论与小结

第四章 鹿蹄草水提物对感染牙根管内部粪肠球菌的体外抑制试验

4.1 材料和方法

4.1.1 主要试剂和仪器

4.1.2 鹿衔草水提物的制备

4.1.3 离体牙根管的制备

4.1.4 粪肠球菌感染牙根管模型的建立

4.1.5 鹿衔草水提物对牙根管中粪肠球菌的杀菌作用研究

4.1.5 统计

4.2 结果

4.3 讨论与小结

第五章 鹿衔草抑菌机理研究

5.1 实验材料

5.1.1 仪器

5.1.2 试剂和药品

5.2 试验方法

5.2.1 鹿衔草水提物对不同菌株生长曲线的影响

5.2.2 鹿衔草水提物对不同菌株核苷酸泄露的影响

5.2.3 透射电镜的样品处理及观察

5.2.4 AnnexinV—FITC/PI双染法测细胞凋亡

5.2.5 鹿衔草水提物对菌体电导率的影响

5.2.6 细菌总蛋白质SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

5.3 结果

5.3.1 鹿衔草水提物影响不同菌株生长曲线的结果

5.3.2 鹿衔草水提物影响不同菌株核苷酸泄露的结果

5.3.3 透射电镜观察结果

5.3.4 细胞凋亡的检测结果

5.3.5 对菌体电导率的影响结果

5.3.6 细菌总白质SDS-PAGE电泳结果

5.4 讨论与小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文

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摘要

针对细菌耐药性愈发严重的问题,本文以鹿衔草作为研究对象,选取实验室已分离到的耐药菌(粪肠球菌为阳性菌代表,大肠杆菌为阴性菌代表),观察其对耐药菌的抑菌效果以及抑制机理,为临床指导用药提供理论依据。
  本研究所用菌株分离自病猪,采用选择培养基培养、革兰氏染色镜检、PCR扩增16S rRNA的方法进行菌株鉴定,并通过二倍微量肉汤稀释法测定菌株对常用抗生素的敏感性;筛选出14种中药水提物,通过药敏以及微量棋盘稀释法、联合诱导传代方法观察其对粪肠球菌以及大肠杆菌的抑制效果以及中西联合效果;选择粪肠球菌感染牙根管作为疾病模型,并通过平板计数法衡量中药抑菌效果;通过绘制生长曲线、测量和观察细菌胞外核苷酸浓度、透射电镜下的超微结构变化、细菌相对膜电位变化、加药后凋亡比例变化、SDS-PAGE凝胶电泳观察加药后引起细菌总蛋白变化,来推测鹿衔草的抑菌机理,结果如下:
  1.菌种鉴定为粪肠球菌、大肠杆菌,药敏结果显示粪肠球菌对20种抗生素均有不同程度的耐药性,其中粪肠球菌对林可霉素、阿奇霉素、头孢他啶、头孢噻肟、头孢噻呋钠极其耐药;大肠杆菌对头孢曲松钠、阿莫西林、磷霉素、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻呋钠耐药。
  2.14种中药中以鹿衔草抑菌效果最为显著,对粪肠球菌、大肠杆菌最小抑菌浓度分别为2.39mg/ml,19.13mg/ml。当鹿衔草与各抗生素联用时,可以与大部分抗生素产生协同、相加作用。
  3.加入鹿衔草水提液可显著杀灭根管内存活的粪肠球菌(p<0.001),效果显著。
  4.体外抑菌机理实验中,发现鹿衔草可阻碍细菌正常生长,甚至产生不同程度的杀灭效果,可破坏细菌膜层结构,使膜电位和通透性发生异常改变,导致内容物泄露,最终引起细菌细胞结构被破坏,发生崩解死亡以及凋亡现象。另一方面,通过对菌体总蛋白的SDS-PAGE图谱分析及蛋白胶条分析,发现鹿衔草可导致菌体蛋白合成受阻,尤其抑制了代谢过程中各种酶的合成,从而使细菌代谢功能紊乱,进一步发挥抑菌功效。

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