STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型肝脏转录组和蛋白质组差异分析

摘要

合理的动物模型对2型糖尿病(Type2Diabetes mellitus，T2DM)的研究至关重要。链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)对胰腺组织β细胞具有特异毒性作用，因此被广泛应用于糖尿病动物模型的制作。高脂高糖食物联合低剂量STZ诱导T2DM模型具有造模时间短，成模率高和造模成本低等特点，是目前应用最广泛的造模方法，但是人类T2DM的发生与STZ没有直接的关系，目前最理想的T2DM模型制作方法仍为高脂高糖自然食物诱导。本研究旨在通过构建高脂高糖食物联合低剂量STZ诱导和单纯高脂高糖食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型，分别进行模型猪肝脏组织转录水平和蛋白水平的差异分析，并完成差异候选基因在细胞表达水平和小鼠T2DM模型中的表达验证，为T2DM动物模型的合理应用提供科学的理论依据。 主要试验结果如下: 1、STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型构建 选取22头20-22kg雌性巴马小型猪用于T2DM模型制作。随机分为4组:第一组(n=4)用基础饲料饲喂10个月(Control，Ctrl);第二组(n=10)高脂高糖饲料饲喂10个月（DM1_HH）;第三组(n=4)先高脂高糖饲料饲喂6个月后按60mg/kg耳缘静脉注射STZ，接着高脂高糖饲喂至10个月(DM2_HS);第四组(n=4)先基础日粮饲喂6个月后按60mg/kg给予耳缘静脉注射STZ接着高脂高糖饲喂至10个月(DM3_SH)。DM2_HS组和DM3_SH组小型猪全部达到T2DM标准，DM1_HH组有4头小型猪造模成功(4/10)。其中，先高脂高糖饲喂后注射STZ（DM2_HS）能够诱导出高血糖T2DM模型。组织病理分析发现长期高脂高糖饲喂组(DM1_HH，DM2_HS)肝脏发生严重的小泡性脂肪变;STZ处理组（DM2_HS，DM3_SH）小型猪胰腺组织受损严重。 2、STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型肝脏转录组分析 分别选取4组实验小型猪各3头用于肝脏转录组分析，同时达到|log2(Fold Change)|＞1和校正p-value＜0.05则被认定为差异表达基因，结果与DM1_HH组相比，DM2_HS组有17个差异表达基因，其中7个为上调基因，10个为下调基因;DM3_SH组有30个差异表达基因，其中16个为上调基因，14个为下调基因。与DM1_HH组相比，一共有4个共表达差异基因同时注释到DM2_HS组和DM3_SH组，分别为CYR61基因，RPL15基因，RGS1基因和一个未知非编码基因LOC102166695，其中CYR61基因，RPL15基因和RGS1基因均为下调表达基因。 3、STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型肝脏蛋白质组分析 分别选取T2DM模型组小型猪各3头用于肝脏蛋白组学分析，结果显示与高脂高糖自然食物诱导的DM1_HH组相比，一共有50个共表达差异蛋白同时注释到DM2_HS组和DM3_SH组。差异蛋白所涉及的代谢通路涵盖了氨基酸代谢，碳水化合物代谢和化学药物致癌等途径。差异蛋白分析显示，STZ处理组中的UGT2B31和UGT1A62个UGT家族下调蛋白同时参与了氨基酸，碳水化合物和化学药物致癌等通路，初步确定UGT蛋白参与STZ在肝脏中的代谢。STRING数据库在线分析发现RPL家族有3个蛋白(14、15、35A)通过GMPR2还原酶与GPT2、ME3、AGXT、HACL1、RDH11、AKR1A1、CBR3和UGT2B31(ENSSSCG00000024213)存在互作关系。蛋白质组学和转录组学联合分析发现，STZ诱导的小型猪T2DM模型肝脏组织中RPL15基因在转录水平和蛋白水平均呈现下调表达模式，证明STZ在诱导糖尿病的发生过程中能够下调RPL15基因在肝脏中的表达，Western Blot试验验证了这一结果。 4、候选基因RPL15的克隆和细胞水平的功能验证 克隆广西巴马小型猪RPL15基因，发现RPL15基因具有高度的保守性，与NCBI公布的猪（Sus scrofa）的RPL15基因同源性高达99.8％，在CDS区第339位点发生G/A同义突变，未引起氨基酸序列的改变。通过在HEPG2肝脏细胞中分别进行干扰和过表达RPL15试验，初步确定RPL15基因与AGXT、RPL14、AKR1A1、GMPR2和UGT2B31存在稳定的互作关系。过表达RPL15可促进癌基因DLK1、HTA、MXR7和抑癌基因P53的表达，同时抑制抑癌基因PTEN的表达;干扰RPL15基因可促进抑癌基因PTEN、NDRG1的表达。 5、候选基因RPL15在小鼠T2DM模型中的表达分析 通过高脂高糖饲料联合低剂量STZ（60mg/kg每天单次腹腔注射，连续注射3d）分别构建昆明小鼠T2DM模型。T2DM模型小鼠组织表达分析发现，RPL15基因在小鼠肌肉、肾脏和肝脏组织中表达较高。与单纯高脂高糖饲喂诱导的mHH组相比，高脂高糖饲喂联合低剂量STZ诱导的mHS组和mSH组小鼠心脏、肝脏、肌肉和肾脏中RPL15基因均呈现下调表达趋势。模型小鼠肝脏中RPL15基因在mHH组中的表达高于mHS组和mSH组，与巴马小型猪T2DM模型研究结果相同。 综上所述，本研究成功构建STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型，完成了模型猪肝脏转录组和蛋白质组的差异分析，并获得肝脏转录水平和蛋白水平的差异表达基因，确定STZ在诱导T2DM的发生过程中下调肝脏中RPL15基因的表达。

目录

声明

摘要

文中关键缩略词中英文对照

第一章综述

1 2型糖尿病简介

2 T2DM实验动物模型的研究进展

2．1自发型T2DM动物模型的应用

2．2诱导型T2DM动物模型的应用

3 STZ与T2DM动物模型

3．1 STZ的结构特点

3．2 STZ给药途径和应用剂量的研究

3．3 STZ的分解和代谢

3．4 STZ在动物模型中的实际应用

3．5高脂高糖饮食联合低剂量STZ诱导T2DM动物模型的优点

4肝脏与T2DM的关系

4．1肝脏中的糖代谢

4．2肝脏与胰岛素抵抗

5转录组学和蛋白质组学技术在糖尿病研究领域的应用

5．1转录组学在糖尿病研究中的应用

5．2蛋白质组学在糖尿病研究中的应用

6小型猪疾病模型的应用和发展

7研究目的和意义

第二章STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型构建及成模特点比较分析

1材料

1．1试验动物

1．2动物日粮

1．3试验耗材和试剂

1．4试验仪器

2试验方法

2．1试验动物的饲养

2．2血液生理生化指标的测定

2．3静脉注射葡萄糖耐实验(IVGTT)

2．5病理切片制作

2．6巴马小型猪T2DM模型标准

2．7数据处理

3结果

3．1体重测定

3．2血清生理生化指标测定结果

3．3静脉葡萄糖耐试验结果

3．4 HOMA-IR计算

3．5病理试验结果

4讨论

5本章小结

第三章STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型肝脏转录组比较分析

1材料

1．1动物样品

1．2试验试剂

1．3试验仪器

2试验方法

2．1转录组建库测序方法

2．2转录组数据分析方法

3．1 RNA提取和检测

3．2样品测序数据统计

3．3测序片段与参考基因组比对结果

3．4样品RNA-Seq相关性分析

3．5差异表达基因统计

3．6 GO分析差异基因功能

3．7 KEGG分析差异基因功能

3．8差异基因表达验证

4讨论

5本章小结

第四章STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型肝脏蛋白质组学比较分析

1材料

1．1动物样品

1．2试验试剂

1．3试验仪器

2方法

2．1 iTRAQ标记定量蛋白质组学技术流程

2．2蛋白质组学数据分析方法

2．3转录组学和蛋白质组学联合分析方法

2．4 Western Blot方法

3结果

3．1 iTRAQ标记试验结果

3．2差异蛋白统计结果

3．3差异蛋白聚类热图

3．4差异蛋白GO分析

3．5差异蛋白KEGG分析

3．6差异蛋白网络互作(PPI)分析

3．7转录组学和蛋白质组学联合分析结果

3．8 Western Blot验证RPL15基因的表达

4讨论

5本章小结

第五章候选基因RPL15的克隆和细胞水平的功能验证

1材料

1．1试验动物样品

1．2试验细胞株及质粒

1．3试验试剂

1．4试验仪器

2试验方法

2．1肝脏样品RNA的提取和cDNA的合成

2．4 RPL15基因序列分析

2．6 RPL15基因干扰载体构建

2．7 HEPG2细胞复苏与培养

2．8 HEPG2细胞转染

2．9 qRT-PCR检测RPL15互作基因的表达

2．10 qRT-PCR检测相关癌基因和抑癌基因的表达

2．11数据处理和分析

3结果

3．2广西巴马小型猪RPL15基因序列分析

3．3 RPL15基因真核表达载体酶切验证

3．4 HEPG2肝脏细胞RPL15基因过表达结果

3．5 HEPG2肝脏细胞RPL15基因表达干扰结果

3．6 RPL15互作基因的表达验证

3．7 HEPG2肝脏细胞中癌基因和抑癌基因的表达

4 讨论

5本章小结

第六章候选基因RPL15在小鼠T2DM模型中的表达分析

1材料

1．1试验动物

1．2动物日粮

1．3试验耗材和试剂

1．4试验仪器

2试验方法

2．1试验动物的饲养

2．2空腹血糖检测

2．3腹腔注射葡萄糖耐试验(IGTT)

2．5 Western Blot验证小鼠肝脏RPL15基因的表达

2．6数据分析

3结果

3．1体重测定

3．2空腹血糖(FBG)测定结果

3．3腹腔注射葡萄糖耐试验(IGTT)结果

3．4小鼠RPL15基因组织表达分析

3．5 Western Blot验证RPL15蛋白在肝脏的表达

4讨论

5本章小结

1总结

2本研究的创新点

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况