脓毒症氧化应激的临床研究及丙酮酸乙酯对脓毒症小鼠氧化应激肝细胞损伤的保护机制研究

摘要

外科感染是术后常见并发症之一，感染导致脓毒症的直接后果是手术患者死亡率上升。机体在脓毒症状态下产生过量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)导致氧化-还原不平衡状态，称为氧化应激。氧化应激所产生的ROS是细胞内主要的信号传导第二信使系统，ROS使一些具有特定功能的细胞因子基因转录增加，促进体内细胞因子释放，引起失控的炎症反应，出现所谓“炎症反应级联效应”，其结果造成组织细胞损伤和毛细血管通透性增加，最终出现多个器官功能障碍。 动物实验研究结果已经表明氧化应激与器官功能受损直接相关，脓毒症产生的ROS可导致心脏、胃肠道、肾脏、肺、肝脏功能受损。肝脏是脓毒性休克中首先表现出损伤的器官，在脓毒症早期即可出现丙氨酸转氨酶、胆红素升高。由于肝脏的Kuffer细胞充当体内“清道夫”，肝细胞受损的结果是细菌及其产物清除障碍，体内炎症反应得不到遏制，而持续存在的炎症反应又会加重肝功能损害。目前认为脓毒症时肝细胞内氧化还原状态改变和它介导的氧化应激是导致肝细胞损伤的主要因素。本课题前期着重在临床研究外科脓毒症患者的体内氧化还原状态及其对器官功能的影响，以获取脓毒症患者氧化还原状态的资料。在此基础上深入研究脓毒症发病过程中肝脏的氧化还原状态，研究丙酮酸乙酯(ethylpyruvate，EP)保护脓毒症小鼠肝细胞的作用机制，探索脓毒症的新型防治策略。 材料与方法：临床研究中山大学附属第一医院外科ICU患者31例，根据有无感染将病例分为两组：脓毒症15例，非脓毒症16例，研究对象进入ICU后第1，3天抽血留取样本，测定血清丙二醛(malonaldehyde，MDA)浓度，同时在相应时间记录患者出现功能障碍的器官数目。 实验研究制作小鼠盲肠结扎穿孔(cecalligation-perforation，CLP)模型，应用含抗氧化剂的丙酮酸乙酯林格氏液(Ringer'sethylpyruvatesolution，REPS)与乳酸钠林格氏液(Ringer'slacticsolution，RLS)进行脓毒症液体复苏，根据所用复苏液体的不同将实验动物分为假手术组(n=20)、CLP模型+REPS组(n=20)、CLP模型+RLS组(n=20)。制作脓毒症模型后第18小时将动物处死，留取血清和肝组织标本待测。应用比色法测定肝组织MDA、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、总抗氧化能力(totalantioxidativecapability，T-AOC)、一氧化氮(nitricoxidase，N0)浓度及血清N0、丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)、血乳酸浓度；应用酶联免疫吸附测定法测定血清肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactoralpha，TNFα)、白细胞介素(interleukin，IL)6、IL-10浓度；应用逆转录聚合酶链式反应测定肝组织细胞TNFαmRNA、IL-6mRNA、iNOSmRNA表达量；应用免疫组化法测定肝细胞热休克蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)的表达量。 统计学方法均数比较应用单因素方差分析和t检验，相关分析采用Spearman等级相关和直线相关分析，p＜0.05表示差异有统计学意义。 结果： 第一部分脓毒症组患者MDA水平较为非脓毒症组升高，差异有统计学意义(p＜0.01)；脓毒症组患者第一、三天的MDA差异无统计学意义(p＞0.05)。非脓毒症组患者的MDA在第三天显著降低，差异有统计学意义(p＜0.01)。随着MDA水平的增高，患者受损器官的数目有增加趋势，Spearman等级相关系数r=0.850，显示MDA与器官功能障碍存在相关性(P＜0.01)。 第二部分CLP小鼠体内抗氧化能力降低，MDA数值较假手术组增高，SOD、T-AOC数值较假手术组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)；EP可增加抗氧化能力，与RLS组相比，REPS组MDA数值降低，SOD、T-AOC数值升高，差异有统计学意义(p＜0.01)。REPS组血乳酸值较RLS组显著性降低，p＜0.01。REPS组血清ALT较RLS组降低，差异有统计学意义(p＜0.01)。 第三部分与RLS组比较，REPS组血清TNFα、IL-6、NO浓度降低，IL-10浓度增高，差异有统计学意义(p＜0.01)；REPS组IL-6/IL-10比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；血清N0浓度与肝组织N0浓度有良好的相关关系，r=0.833，p＜0.05。 肝细胞TNFαmRNA、IL-6mRNA、iNOSmRNA表达在REPS组较RLS组低，差异有统计学意义(p＜0.01)。 第四部分REPS组HSP70阳性表达的细胞显著增多，t检验显示差异有统计学意义，p＜0.05。 结论 本研究结果表明： 1、临床脓毒症患者体内存在严重氧化应激状态，氧化应激与器官功能障碍相关。 2、丙酮酸乙酯具有显著的抗氧化效应，提高脓毒症肝细胞的抗氧化能力，从而改善肝功能。 3、丙酮酸乙酯改善微循环状态和细胞能量代谢状态，有效降低血乳酸水平。 4、丙酮酸乙酯降低肝细胞的细胞因子基因表达，调节脓毒症的细胞因子平衡状态，减轻炎症反应的不良作用。 5、丙酮酸乙酯减轻肝细胞氧化应激反应可以促进肝细胞HSP70表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词汇表

前言

第一部分脓毒症患者氧化应激状态的临床研究

第二部分丙酮酸乙酯对脓毒症小鼠肝细胞抗氧化作用的研究

第三部分丙酮酸乙酯对脓毒症小鼠细胞因子及其基因表达的调节作用

第四部分丙酮酸乙酯对脓毒症肝细胞热休克蛋白70的调节作用

结论

创新与展望

参考文献

脓毒症氧化应激与核因子κB的研究

致谢