四逆汤及银杏叶制剂防治阿霉素性心力衰竭的作用及线粒体机制研究

摘要

心力衰竭几乎是所有心血管疾病终末期的共同结局。尽管不断有新的治疗方法出现，虽然可以降低部分心血管疾病(特别是急性心肌梗塞)的死亡率，但是慢性心力衰竭的发病率和死亡率却一直难以得到有效地控制。目前心衰的防治方法很多，但均不能令人满意地阻止心力衰竭的发展或逆转其病理改变，因此，深入探讨其发病机制，以求找到更恰当更有效的预防和治疗策略，是当前心力衰竭研究的重点之一。近年来随着细胞凋亡、氧化应激与心力衰竭关系的提出，线粒体在氧化应激导致的细胞凋亡通路中的作用，引起了国内外学者的重视，成为研究心力衰竭防治新的增长点。 中医中药有着数千年的历史，对于复杂疾病的成因和发展可以进行多靶点全方位的调节。中药治疗心衰已经逐渐成为防治心衰的一条重要途径。四逆汤是医圣张仲景《伤寒论》中所创经典名方，该方以回阳救逆的功效而著名。多年来，本课题组对四逆汤抗心肌缺血的作用做了系统研究，四逆汤可增强心肌收缩力，扩张冠脉，改善心肌供血；清除氧自由基，抑制脂质过氧化，抗氧化应激作用；增加心肌ATP含量；提高Bcl-2基因的表达，降低p53基因的表达。银杏叶又名白果叶，为银杏科植物银杏(GinkgoBiloba)的干燥叶。其所含主要成分银杏黄酮甙具有有效清除体内有毒过氧自由基的作用。研究还发现，银杏叶具有扩张冠状动脉，改善心肌缺血区的血液循环，减低心肌耗氧量；提高小鼠心脏和脑对缺氧的耐受力；降低缺氧复氧心肌细胞p53蛋白的表达，恢复bcl-2蛋白的表达等作用。因此，四逆汤和银杏叶有可能从抗心肌组织及其线粒体氧化损伤的角度，来改善心肌能量代谢，降低氧化应激，减少心肌细胞凋亡的发生，从而多环节地起到改善心功能，防治心衰发生发展的作用。本实验即观察中药方剂四逆汤与经典的抗氧化药物银杏叶提取物防治阿霉素性心力衰竭的作用及其线粒体机制，并将四逆汤与银杏叶提取物的作用进行对比研究，为心力衰竭的中药治疗及阿霉素性心肌毒性的心肌保护药物的开发提供坚实的实验室依据。 一、四逆汤及银杏叶制剂防治阿霉素性心力衰竭的作用研究 实验动物随机分为4组：对照组、模型组、四逆汤组和银杏叶提取物组。对照组大鼠尾静脉注射与模型组及用药组注射的盐酸阿霉素(3mg/kg)等体积的生理盐水，1次/5天，共注射3次，第三次注射后第二天开始，对照组和模型组双蒸水灌胃。四逆汤组以四逆汤煎剂灌胃，3.75g生药/kg体重。银杏叶组以银杏叶提取物溶液灌胃，100mg/kg体重。 1.四逆汤及银杏叶提取物对阿霉素性心衰大鼠心功能的影响 脏器系数：模型组大鼠的肝脏和脾脏脏器系数显著升高，而以四逆汤和银杏叶提取物灌胃后，大鼠的肝脏和脾脏脏器系数明显下降(p＜0.01)，心脏的脏器系数在各组间比较，均未见明显的统计学差异(p＞0.05)。 病理学观察：四逆汤和银杏叶组可以明显改善模型组大鼠心肌组织的紊乱排列及肌纤维的断裂，改善肝脾组织的淤血，保证了组织的正常结构。 心导管检测结果显示：模型组大鼠左心室舒张末期的压力(LVEDP)显著增高(p＜0.01)，说明左室收缩功能减弱，应用四逆汤和银杏叶提取物后，LVEDP得到明显改善(p＜0.05)。模型组大鼠的±dp/dtmax均较对照组显著降低(p＜0.01)，结合LVEDP的升高，说明模型组大鼠发生了心力衰竭，心肌的收缩性和舒张性能均出现异常。四逆汤和银杏叶提取物的应用则可显著改善心肌的舒缩性能(p＜0.01)，提高心衰大鼠的心功能。 2.四逆汤及银杏叶提取物对心力衰竭大鼠机体氧化应激指标的影响 血液SOD活性及MDA含量：注射阿霉素后l天，各组大鼠血液SOD活性与对照组相比有所下降，MDA含量有所升高，但未见统计学差异。而随着时间的延长，心衰组大鼠血液SOD活性明显下降，MDA含量逐渐增多，注射后l周、2周和3周与对照组相比均有明显的统计学差异(p＜0.05)，经过四逆汤和银杏叶提取物治疗后，可以有效地防止阿霉素造成的血液SOD活性下降及MDA生成的增多(p＜0.05)。 心肌组织的SOD活性和MDA含量检测结果：模型组SOD活性显著减低，MDA含量显著增多(p＜0.01)，说明心衰大鼠心肌抗氧化能力下降，心肌发生明显的膜脂质过氧化反应；而四逆汤和银杏叶提取物可以显著提高心肌组织SOD活性降低MDA含量(p＜0.01)，有效保护了机体自身的抗氧化酶活性，提高机体对氧化损伤的防御能力，同时减轻细胞的氧化损伤及膜脂质过氧化反应。 3.阿霉素性心力衰竭与心肌组织氧化应激的相关性分析 相关性分析表明，随着心衰大鼠心肌LVEDP的增加，心肌组织SOD活性下降，而MDA含量则逐渐增加，表明LVEDP与心肌细胞的SOD活性呈负相关(p＜0.05)，与心肌细胞的MDA含量呈正相关(p＜0.05)。 结果提示，阿霉素的应用可导致大鼠心功能下降，用药3周后会出现心力衰竭的表现，同时机体氧化应激反应增强。并且阿霉素所致的心功能的下降与氧化应激作用密切相关，随着氧化应激的加重，心功能损伤也越严重，最终导致心力衰竭的发生。而四逆汤和银杏叶提取物的应用，可以明显改善阿霉素造成的心功能降低，二者之间未见明显的统计学差异。提示，四逆汤和银杏叶提取物均可能是通过保护心肌组织的正常结构，减轻肝脾淤血肿胀程度，降低阿霉素所致的氧化应激反应，提高机体的抗氧化能力，从而保护了心肌细胞，提高了大鼠的心功能。 二、四逆汤及银杏叶制剂防治阿霉素性心衰心肌线粒体损伤的作用研究 三、四逆汤及银杏叶制剂防治阿霉素性心衰心肌细胞凋亡的线粒体机制研究 结果提示，阿霉素造成的心力衰竭的机制可能是由于氧自由基产生的增多，导致心肌细胞氧化损伤，出现氧化应激，激活Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bid，使其由胞浆中转移到线粒体膜上，抑制Bcl-2及Bcl-xl的抗凋亡作用，并参与促成线粒体膜的损伤，线粒体通透性增加，PT孔开放，细胞色素C和AIF等蛋白由线粒体内膜释放到细胞浆中，进而产生级联反应，细胞色素C可激活Caspase-9，并激活下游的Caspase-3，切割特异性底物，如维持细胞内环境稳定的必需结构蛋白、代谢和修复蛋白等，激活内源性核酸内切酶，造成DNA的裂解破坏形成DNA片段，促进细胞凋亡的发生；而AIF则可能直接作用于细胞核，通过非Caspase依赖的途径，也起到促进细胞凋亡的作用。相关性分析表明，心力衰竭组中，随着氧化应激的增强，Bid蛋白的表达也增多；而随着Bid蛋白表达的增多，线粒体释放细胞色素C增加，并且细胞凋亡率也相应升高。在本实验的条件下，我们也比较了四逆汤和银杏叶提取物的作用，结果发现，二者具有相似的抗阿霉素性心力衰竭的作用，其机制均与线粒体途径导致的心肌细胞凋亡有关。因此，四逆汤和银杏叶提取物则可能在这个氧化应激-线粒体损伤-细胞凋亡的途径上，作用于相应的细胞因子靶点，提高心肌细胞和线粒体的抗氧化能力，减低膜脂质过氧化反应，抑制促凋亡蛋白Bid的活性，提高抗凋亡因子Bcl-xl蛋白和基因的表达，保护了线粒体功能，减少细胞色素C和AIF的释放，及阻止Caspase蛋白酶的活性，从而起到抑制心肌细胞凋亡，提高心功能的作用。四逆汤是我国的经典名方，银杏叶提取物是目前公认的抗氧化药物，我们的研究为应用四逆汤等中药进行阿霉素性心肌毒性的心肌保护治疗提供坚实的理论依据。 结论： 1.本实验中的心力衰竭模型存在有明显的心肌组织和线粒体氧化应激状态，及心肌细胞的凋亡。相关分析表明，心衰时心功能的下降与机体的氧化应激状态和心肌细胞凋亡关系密切。线粒体损伤，细胞色素C，AIF等蛋白释放，Caspase-9、Caspase-3蛋白酶的激活在心肌细胞凋亡的发生中有重要作用。 2.四逆汤可以明显改善阿霉素性心力衰竭大鼠的症状和体征，提高心功能，降低心肌组织及线粒体的氧化损伤，提高机体抗氧化酶Cu-ZnSOD和MnSOD的基因表达和蛋白活性，抑制心肌细胞凋亡。 3.四逆汤对抗阿霉素性心力衰竭心肌细胞凋亡的机制可能是通过保护线粒体功能，减少细胞色素C和AIF的释放，及阻止Caspase-9、3蛋白酶的激活，提高抗凋亡基因Bcl-xl的基因和蛋白表达来实现的。 4.在本实验条件下，抗氧化药物银杏叶提取物具有明显的抗阿霉素性心力衰竭的作用，其提高心功能，保护心肌细胞的作用机制也可能是通过改善机体的抗氧化功能，保护线粒体，减少线粒体途径诱发的心肌细胞凋亡而实现的。四逆汤具有与其相类似的抗心衰作用。 创新点：1.探索了氧化应激-线粒体损伤-细胞凋亡在阿霉素性心肌毒性造成的心力衰竭中的作用。 2.从抗氧化应激的角度出发，探索了中药方剂四逆汤对阿霉素性心力衰竭心肌细胞及其线粒体的保护作用。 3.从线粒体介导的细胞凋亡途径入手，阐释了四逆汤抗阿霉素性心力衰竭心肌细胞凋亡的机制。 4.进行四逆汤作用研究的同时，亦以线粒体为中心，在蛋白和基因水平对抗氧化药物银杏叶提取物进行了对照研究。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第1章四逆汤及银杏叶制剂防治阿霉素性心力衰竭的作用研究

引言

1.1材料

1.2方法

1.3实验结果

1.4讨论

第2章四逆汤及银杏叶制剂防治阿霉素性心衰心肌线粒体损伤的作用研究

引言

2.1材料

2.2方法

2.3实验结果

2.4讨论

第3章四逆汤及银杏叶制剂防治阿霉素性心衰心肌细胞凋亡的线粒体机制研究

引言

3.1材料

3.2方法

3.3实验结果

3.4讨论

小 结

参考文献

附图1

附图2

附图3

攻读博士学位期间所取得的成绩

缩略词表

致 谢

原创性声明