质粒介导HER-2 RNA干扰治疗HER-2阳性乳腺癌体内外研究

摘要

近年来，我国乳腺癌的发病率迅速上升。乳腺癌已经是危害我国妇女健康的主要恶性肿瘤之一。约有25-30％乳腺癌病人的癌组织表达HER-2，而且这些HER-2阳性的病例往往发展快，对多种化疗和内分泌治疗不敏感，预后较差，容易转移复发。 HER-2是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体，分子量约为185kD，又被称为p185，它是人类表皮生长因子受体(EGFR)家族中的成员之一。目前抗HER-2治疗的途径主要有以下几类：(1)抗HER-2单克隆抗体，通过封闭乳腺癌细胞表面HER-2受体，阻断其与各种生长因子的结合，从而抑制受体激活；(2)酪氨酸激酶抑制剂；(3)反义基因技术。但由于抗HER-2单克隆抗体本身限制及酪氨酸激酶抑制剂副作用较严重，而反义基因方法抑制基因表达的效果又较弱，故他们都不能达到满意的临床效果。因此，开发一种更加有效、安全的抗HER-2药物成为研究的热点。 因此本课题设计了以HER-2/neu基因为靶标的siRNA插入片断，构建HER-2-shRNA表达质粒载体，观察其对乳腺癌SKBR-3细胞株HER-2mRNA及HER-2蛋白表达的影响，并观察其对细胞增殖能力和凋亡的影响及对化疗药物敏感性的影响；同时在体内研究其抑制HER-2阳性肿瘤生长抑制情况。 材料与方法HER-2-shRNA目的序列的筛选及表达载体的构建和鉴定 根据Tuchle经典siRNA设计方法设计并选取HER-2/neu基因特异的、并且与其他HER家族成员同源性最小的siRNA序列。根据载体psilencer1.0-U6(pU6)的ApaI和EcoRI酶切位点设计插入的DNA寡核苷酸片段序列。psilencer1.0-U6经过扩增、抽提、双酶切、线性质粒纯化后，与退火处理的双链DNA片段进行连接重组。重组质粒进行HindⅢ酶切初步筛选后，测序鉴定。 对照质粒为已经重组构建成功的GFP-shRNApsilencer1.0-U6质粒载体。细胞培养、细胞转染及实验分组SKBR-3细胞用高糖DMEM培养基，置于含5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养。实验分组为对照组(转染试剂)、GFP-shRNA质粒转染组(转染试剂+GFP-shRNA质粒)、HER-2-shRNA质粒转染组(转染试剂+HER-2-shRNA质粒)三组。 第一天细胞铺板，铺板密度分别为：6孔板5×105个/孔；24孔板1×105个/孔；96孔板5×103个/孔。第二天至细胞密度达到70-80％时开始转染。用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine2000，转染72小时后进行检测。 半定量RT-PCR检测细胞转染后mRNA水平HER-2/neu基因表达的影响 Trizol试剂分别提取各组细胞的总RNA，以HER-2和β-actin相应引物进行半定量RT-PCR，琼脂糖凝胶电泳后在观察照相。然后以KontrinIbas全自动图像分析系统进行图像分析。 Wenten-Blot及免疫组化分析细胞转染后HER-2蛋白表达的情况 将各处理组细胞裂解并提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE电泳，然后小鼠抗人HER-2/neu单克隆抗体和β-actin单克隆抗体为一抗进行Westernblot。ECL化学发光曝光后进行图像分析。 转染前，在6孔板预置盖玻片，染72小时后，提取盖玻片，清洗后，用免疫组化SABC方法分析HER-2表达情况。 流式细胞仪(FCM)检测细胞周期及TUNEL(DNA切口末端标记法)分析细胞凋亡情况 各处理组细胞以70％冰乙醇，固定过夜，然后以RNA酶处理和PI染料染色，流式细胞仪进行检测。 取转染后各组的细胞爬片，多聚甲醛室温固定后，按照细胞凋亡检测试剂盒(InSituCellDeathDetectionKit)说明进行操作。DAB显色后计数细胞，计算凋亡细胞百分比。 MTT法检测肿瘤细胞生长及对化疗药物的敏感性 SKBR-3乳腺癌细胞株以5×103/孔接种细胞至96孔板上，细胞转染72h之后加MTT孵育4h，酶标仪检测光密度。以pU6转染组为空白对照组，计算各转染组相对空白对照组的百分比，测定细胞活力。 同上述方法相同，转染后72小时，将不同浓度表阿霉素加入各组细胞，48小时后测试细胞活力。 HER-2阳性动物模型及原位乳腺癌肝转移模型的建立 4-6周龄雌性裸小鼠，在第二对乳房垫原位种植5×106个SKBR-3细胞，形成肿瘤后再将肿瘤移植到裸鼠第二对乳房垫，放在SPF环境中饲养，形成原位HER-2阳性乳腺癌模型。 原位肝转移模型的建立在正常环境下进行。在SKBR-3细胞在体内形成肿瘤后，取肿瘤种植在裸鼠原位，等到裸鼠肿瘤长成后，取其中一只再进行裸鼠肿瘤原位移植，观察裸鼠的肿瘤生长情况及肝肺转移情况。 载体介导的RNA干扰药物传递及观察 实验动物按照空白对照，阴性对照及治疗分为三组。空白组无任何处理，阴性对照注射GFPshRNA，治疗组注射HER-2shRNA；将脂质体转染药物同载体介导的RNA干扰药物混合，在体外孵育20分钟后，按照肿瘤体积大小分别将其注射到正常环境及SPF环境下的动物模型肿瘤内，每周观察肿瘤大小及动物生存状态。 结果重组质粒的筛选和鉴定 HER-2-shRNA表达载体重组构建成功，酶切初步筛选后，测序鉴定序列完全正确。 半定量RT-PCR检测细胞转染后mRNA水平HER-2基因表达的影响 HER-2-shRNApU6质粒转染SKBR-3细胞72h后，HER-2mRNA水平较对照组有明显下降(下降约60％左右)；GFP-shRNApU6质粒转染组细胞的HER-2mRNA水平较对照组无明显变化。 Wenten-Blot及免疫组化分析细胞转染后HER-2蛋白表达的情况 细胞转染72h后，提取各处理组细胞蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot检测，成像后进行图像分析，分析结果显示HER-2-shRNApU6质粒转染组细胞的HER-2蛋白水平较对照组下降55％左右；GFP-shRNApU6质粒转染组细胞的HER-2蛋白水平无明显变化。 HER-2免疫组化分析发现，经过HER-2shRNApU6转染后，HER-2在细胞膜上的表达明显降低，而两个对照组没有明显变化。 HER-2基因干扰对SKBR-3细胞周期分布的影响及凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示：HER-2-shRNA转染组的G0/G1期细胞比例较对照组增加约9％左右，并且凋亡细胞比率增加；而GFP-shRNA转染组和对照组G0/G1期细胞比例、凋亡细胞比率几乎没有明显差别。 SKBR-3细胞转染后，用TUNEL法分细胞凋亡，计数凋亡细胞数，计算凋亡细胞百分比。结果为：HER-2-shRNApU6质粒转染组凋亡细胞百分比较对照组增加6.3％；GFP-shRNApU6质粒转染组和对照组间无明显差异。 MTT法检测HER-2基因干扰对肿瘤细胞生长及对化疗敏感性的影响 HER-2-shRNApU6质粒转染抑制HER-2/neu基因表达能明显抑制SKBR-3细胞生长。细胞转染后，HER-2-shRNAPu6转染组细胞生长分布不均，成片状。MTT结果显示该组细胞生长活力明显减弱(P＜0.05)。 HER-2-shRNApU6质粒转染提高了SKBR-3细胞对化疗药物表阿霉素的敏感性，相比对照组，肿瘤细胞对表阿霉素的敏感性增加了10多倍。 HER-2阳性原位乳腺癌模型及原位乳腺癌肝转转模型的建立 所有在SPF环境或者非SPF环境下的原位HER-2阳性肿瘤模型都获得成功，在非SPF环境下没有出现明显的并发症及动物死亡。 经过3次体内筛选，正常饲养环境下，肿瘤的恶性度出现增加，肿瘤出现肝转移的频率明显增高，达到81％，没有发现明显的肺转移。 体内HER-2shRNA抑制HER-2阳性乳腺肿瘤的生长 经过10周观察，没有动物出现非肿瘤性死亡。在10周时，肿瘤的大小在HER-2shRNA比两个对照组明显要小，分别为3661.99±825.65mm3及3776.30±675.65mm3，1927.56±425.09mm3(p＜0.05)；抑制效果在肿瘤较小的时候更明显，尤其是当肿瘤直径小于0.5cm时。 结论1.表达HER-2-shRNA的重组psilencer1.0-U6质粒转染后，明显地抑制乳腺癌SKBR-3细胞HER-2mRNA和蛋白的表达水平。 2.HER-2-shRNApU6质粒转染，HER-2基因干扰可以抑制乳腺癌细胞SKBR-3的生长，并引起细胞阻滞在G0/G1期。 3.HER-2-shRNApU6质粒转染，HER-2基因干扰可以诱导乳腺癌细胞SKBR-3凋亡。 4.HER-2-shRNApU6质粒转染在体外可以明显提高SKBR-3对化疗药物表阿霉素的敏感性。 5.利用肿瘤组织块移植可以获得大小比较一致的HER-2阳性动物模型。 6.HER-2阳性肿瘤在体内经过筛选后可以出现恶性度增加，导致肝转移。 7.HER-2-shRNApU6质粒能够抑制体内HER-2阳性的乳腺癌生长，提示了良好的治疗应用前景。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分HER-2-siRNA表达质粒载体的构建和鉴定

第二部分体外HER-2-siRNA表达质粒载体对HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR-3生物学功能影响

第三部分体内HER-2-siRNA表达质粒载体及化学合成HER-2 siRNA对HER-2阳性乳腺癌动物模型的治疗效果

结论

本研究的特色及创新之处

攻读博士学位期间发表的论文

参考文献

英文缩略词表

致谢