原核形态、卵裂胚发育与染色体异常的关系

摘要

在过去的二十多年里，体外受精—胚胎移植迅猛发展。妊娠率从早期非常低的水平发展到如今的40％左右。然而，这妊娠率直接和移植多个胚胎有关。移植多个胚胎是依据目前选择胚胎移植的标准，胚胎移植后的种植率只有20％-30％。这意味着在移植到子宫内的胚胎中，有近70％-80％是不能种植的，因此，为了保证一定水平的妊娠率，往往选择2-3个胚胎移植。为了降低多胎妊娠率，有越来越多的国家制定严格的法规，控制移植胚胎数目。为此，我们应该选择最有发育潜能的胚胎移植，减少移植胚胎的数目。 如今，选择胚胎移植主要有形态学指标、胚胎种植前诊断、囊胚培养、生化指标等这几种方法。其中，形态学指标是目前最常用的方法，这是因为这种方法具有简单、快捷、无创性等优点。具体指标包括：原核形态、第一次卵裂的时间、卵裂期胚胎的形态学及评分等。卵裂期胚胎评分系统的主要形态学参数有卵裂球的数目、大小、形状、对称性、胞浆的形态、碎片的比例、有无多核细胞、细胞的紧密程度等，在临床工作中根据形态学参数还建立了各种胚胎分级标准。 近年来发现原核的形态能很好地预测胚胎发育潜能。目前主要有两种原核评分体系。1998年Scott和Smith，根据原核和核仁的排列方式、胞浆的外观、有无提前分裂，提出了他们的原核评分方法；根据分数的高低选择胚胎移植，当原核评分>15分时，种植率为28％，分娩率为65％。1999年Tesarik和Greco将原核分为0-5型共6种类型。其中0型原核为理想的形态，其它为不理想。0型原核胚胎发育停滞率为8.5％，而其它5种类型的原核发育停滞率为20％—31％。 为什么原核形态可以预测胚胎发育潜能？为什么结合原核评分和胚胎形态学评分选择胚胎移植可以有更高的妊娠率和种植率？在近期的一些研究中发现原核形态和胚胎的染色体状况有关，2002年Kahraman等根据原核中核仁前体的分布、原核的排列、胞浆的外观对原核进行评分，发现从评分高的原核发育而来的胚胎中染色体异常的比例低于原核评分低的胚胎；2003年Gamiz等研究了原核的形态和胚胎发育以及染色体的状况，发现两个原核大小相当、核仁前体呈线性排列的合子发育到桑葚胚和囊胚的机会明显增加，从这类合子发育而来的胚胎染色体异常的机会明显降低。Gianaroli等研究发现原核长轴和极体的位置也影响胚胎的发育潜能和胚胎的染色体状况，他们的研究发现最常见的位置是极体和原核的长轴垂直，其次是极体位于原核的长轴上，其余的20％为极体位于原核长轴的不同角度；其中由α型原核发育而来的胚胎有86％达到可利用的标准，β型为83％，均非常显著地高于γ型的57％；经FISH分析后，由α型原核发育而来的胚胎有36％是正常的，β型为33％，二者均非常显著地高于γ型的7％。2004年Balaban等根据Tesarik和Greco的原核评分体系对原核的评分与胚胎发育、胚胎的染色体状况进行研究，结果发现从0型原核发育而来的胚胎非整倍体率为25.6％，而从一个或两个形态异常原核发育而来的胚胎的这一比例分别为73％和83％。 从目前的研究结果来看，原核形态、胚胎发育与胚胎染色体状况有一定的关系，但相关的研究资料并不多，特别是对原核评分与胚胎染色体的状况之间的关系的研究，全世界相关的文献报道只有5篇左右，国内很少见相关的报道。全世界关于原核排列、核仁分布、胞浆外观与胚胎发育以及胚胎染色体状况的研究只有2002年Kahraman的一篇报道，并且在Kahraman的研究中，精子来源于严重不育的男性，因此，代表性有一定的局限。本研究的目的是通过研究原核形态、胚胎发育与染色体异常的关系，寻找目前临床上常见的一些原核、胚胎形态学现象背后的本质，并试图寻找原核形态、胚胎发育与染色体异常之间的规律，如果有规律可循，可以应用这些规律来指导我们的日常工作。本研究包括两部分内容，第一部分是用13、18、21、X、Y五色探针同时检测植入前人胚胎非整倍体，目的是建立用13、18、21、X、Y五色探针分析单个卵裂球的方法。第二部分研究原核形态、胚胎发育与染色体异常的关系。 第一部分用13、18、21、X、Y五色探针检测植入前人胚非整倍体的实验研究 目的： 建立同时用13、18、21、X、Y五色探针用于分析单个卵裂球的方法。 方法： 收集IVF/ICSI治疗周期中受精后第三天，不适宜移植和冷冻的正常受精胚胎11个、双精受精胚胎1个用于研究。用Tyrode's酸溶解这些胚胎的透明带，用0.1％Tween-20/0.01 N HCL将卵裂球固定，用Vysis公司的MultiVysion PGTFISH探针进行分析。 结果： 12个胚胎共有46个卵裂球，有核的卵裂球43个，其中有3个卵裂球各有2个核，共有46个细胞核。成功固定45个核，固定成功率为97.8％。43个核有杂交信号，杂交率为95.6％，有2个核因为太致密，没有杂交信号。 11个单精受精胚胎共有39个核有信号，都为二倍体胚胎，其中正常胚胎2个；在9个异常胚胎中，嵌合型胚胎6个，异常非嵌合型胚胎2个，无规律分离型1个。在39个核中，异常核19个，所占比例为48.7％。其中简单异常14个，占异常核的73.7％；复杂异常5个，占26.3％。最常见的异常是13单体，有6个，占所有核的15.4，占异常核的31.6％；其次是21三体，有5个，占所有核的12.8％，占异常核的26.3％。在5种染色体中，13号和21号染色体出现异常的频率最高，均为39.1％。1个多精受精的胚胎表现为无规律分离型。 第二部分原核形态、卵裂胚发育与染色体异常的关系 目的： 探讨原核形态、卵裂胚发育与染色体异常的关系。 方法： 2005年9月—2006年3月对因为反复胚胎种植失败、不明原因的早期习惯性流产需要行PGD的病人7例，用13、18、21、X、Y五色探针筛查这些病人种植前胚胎的非整倍体，同时观察原核评分、胚胎发育与胚胎染色体异常的关系。 结果： 1.7个病人各行PGD一周期，共获卵子101个，正常受精卵子78个，受精率77.2％；有73个正常受精的卵子分裂，卵裂率93.6％；优质胚胎27个，共有52个胚胎达到活检标准，有51个胚胎有诊断结果，经FISH分析为正常的胚胎22个，正常胚胎的比例为43.1％；异常胚胎29个，其中非整倍体胚胎28个，所占比例为54.9％，三倍体胚胎1个。有6个病人有胚胎移植，共移植胚胎15个，冷冻4个胚胎，有一个病人单胎妊娠。 2.由原核评分≥14分的合子发育而来的胚胎49个，为A组；<14分的胚胎24个，为B组。A组中，碎片比例≤20％的胚胎所占比例为51％，显著高于B组的25％，P<0.05。A组卵裂球大小均匀的胚胎占65.3％，显著高于B组的33.3％，P<0.05。在A组胚胎中，≥6细胞期胚胎有32个，所占的比例为65.3％，显著高于B组的33.3％，P<0.05。在A组胚胎中优质胚胎的比例为46.9％，显著高于B组胚胎的20.8％，P<0.05。在有FISH诊断结果、原核评分≥14分的37个胚胎中，正常胚胎的比例为51.4％，高于原核评分<14分胚胎的21.4％，P<0.05。 3.随着碎片比例的增加，正常胚胎的比例下降，胚胎的染色体状况和碎片比例有密切的相关性(r=0.835，P<0.01)。 4.8细胞胚胎中，经FISH分析正常的胚胎比例为55％，显著高于7细胞以下胚胎的30.4％，P<0.05；高于8细胞以上胚胎的比例为50％(4/8)，但无统计学意义，P>0.05；8细胞以上胚胎中正常胚胎的比例高于7细胞以下胚胎(30.4％)，但无统计学差异，P>0.05。 5.在卵裂球数目为偶数的胚胎中，FISH正常的胚胎比例为48.4％(15/31)，在卵裂球数目为奇数的胚胎中，正常胚胎的比例为35％(7/20)，二者无统计学差别，P>0.05。在卵裂球大小均匀的胚胎中，染色体正常胚胎所占比例为54.8％(17/31)；卵裂球大小不均匀的胚胎中，正常胚胎所占比例为25％，显著低于卵裂球均匀组，P<0.05。 6优质胚胎中，正常胚胎的比例为55.6％，显著高于非优质胚胎的29.2％，P<0.05。原核评分≥14分的优质胚胎20个，其中正常胚胎的比例为70％，虽然高于优质胚胎的55.6％，但是无统计学意义，P>0.05。 小结： 1.在种植前胚胎中，染色体异常胚胎广泛存在，其中非整倍体胚胎占染色体异常胚胎的绝大多数。 2.原核评分高的胚胎有更好的发育潜能，其原因是因为原核评分高的胚胎染色体正常的比例高。 3.随着胚胎碎片比例的提高，胚胎发生染色体异常的机会增加，胚胎的染色体状况和碎片比例有密切的相关性。 4.受精后第3天的胚胎发育到8细胞是一种理想的发育速度，这些胚胎中染色体正常的比例，显著高于7细胞以下的胚胎，高于9细胞以上的胚胎。这对我们选择胚胎移植有一定的指导意义，在选择胚胎移植时，如果胚胎的分级相同，选择胚胎移植的顺序应该首先是8细胞期胚胎、然后是9细胞以上胚胎、最后是7细胞以下的胚胎。 5.卵裂球大小均匀的胚胎，染色体正常的比例显著高于不均匀的胚胎。 6.优质胚胎中染色体正常胚胎的比例显著高于非优质胚胎。 7.结合原核评分和胚胎形态学指标选择胚胎移植，能够提高种植率和妊娠率的主要原因是可以筛选出更高比例的染色体正常胚胎移植。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分 用13、18、21、X、Y五色探针检测植入前人胚非整倍体的实验研究

第二部分 原核形态、卵裂胚发育与染色体异常的关系

小结

参考文献

综 述 胚胎植入前遗传学诊断

胚胎体内注射生理盐水在碱胎术中的应用

致 谢