大脑皮层梗塞后继发远隔部位损害与DNA氧化损伤

摘要

中枢神经系统(cerltral nervous system，CNS)和体内其它系统一样，在正常的代谢过程中，会产生活性氧(reactive oxygen：radicals，ROS)。但由于CNS对氧的摄取量比较高，同时抗氧化系统比较弱，所以CNS更易于遭受氧化损伤(oxidative stress)。氧自由基攻击DNA后，可以导致其空间结构的断裂和碱基的修饰。8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hydFOXy-2’-deoxyguansine，8-ohdG)是迄今研究最多的一种嘌呤加合物。 皮层梗塞后可以引起与皮层存在纤维联系的丘脑腹后外侧核(velltroposterior nucleus of the thalamus，VPN)，黑质网状核(substantianigra pars reticulata，SNR)以及脊髓代谢和功能的降低以及病理改变。这些损伤的远隔部位存在着顺行变性和逆行变性。研究发现细胞因子和炎症反应参与了远隔部位的损伤。 8-ohdG和衰老以及一些退行性疾病有关，在人体脑内也发现随着年龄的增长，8-ohdG水平增加。机体细胞主要通过碱基切除修复(base excision repair，BER)来防止DNA氧化损伤(包括8-ohdG)，参与BER的DNA修复酶的变化被认为是反映DNA氧化损伤的敏感指标。 目的 观察大鼠大脑皮层梗死VPN，SNR的DNA氧化损伤以及修复酶的表达，ebselen已被证实具有抗炎及抗氧化的作用，本实验同时研究ebselen对皮层梗塞导致的远隔部位损伤是否具有改善作用，以进一步证实DNA氧化损伤是否参与了大脑皮层梗死后远隔部位的损害。 方法 采用易卒中型肾血管性高血压大鼠(RHRSP)，电凝法建立一侧大脑中动脉皮层支闭塞(MCAO)模型，并将其随机分成： 1)假手术组(10只)，2)模型组(10只)，3)溶剂组(10只，0.5﹪羧甲基纤维素钠+0.02﹪吐温-20)，4)ebselen小剂量组(10只，10 mg/kg，以0.5﹪羧甲基纤维素钠+0.02﹪吐温-20混悬)。5)ebselen大剂量组(10只，30 mg/kg，以0.5﹪羧甲基纤维素钠+0.02﹪吐温20混悬)。其中3，4，5组大鼠术后24h开始灌胃给溶剂或药物，剂量为0.5 ml/100g体重，每24h灌胃一次，共13次。各组动物均在MCAO术后每天记录体重，并采用Bederson评分(postural reflex test)进行神经功能评分。最后一次给药后4 h处死取脑后行苏木素一伊红(HE)，焦油紫(cresylviolet)尼氏染色，免疫组化检测各组大鼠VPN和SNR 8-ohdG及DNA修复酶DNAglycosylase 1(OGG1)和apurinic/apyrimidinic endonuclease(APE)以及Escherichia coli MutY DNA glycosylase(MYH)的表达，Western蛋白印迹检测OGG1，APE和MYH表达量的改变。所有图像均使用Image—Pro Plus 5.0软件分析，全部数据均采用SPSS for Windows 13.0统计软件包进行统计，行单因素方差分析(ANOVA)，比较各组间及各时间点间的差异，P<0.05时，有显著性意义，P<0.01时，有极显著性意义。 MCAO后两周，HE染色显示梗塞同侧VPN和SNR脑细胞损伤，即核固缩，多数呈不规则形态。而同侧及假手术组VPN和SNR未见损伤。VPN ebselen 10mg/kg和30 mg/kg组与VPN溶剂组相比，均未见明显改善作用。SNR的ebselen 10mg/kg组与SNR溶剂组相比，稍有改善作用。而ebselen 30 mg/kg组与SNR溶剂组相比，则有较明显改善作用。MCAO后两周的尼氏染色显示梗塞同侧VPN脑细胞呈现不规则形态，神经胞体缩小，尼氏体崩裂呈颗粒状，出现萎缩的深色细胞。而同侧及假手术组VPN未见损伤。溶剂和ebselen 10 mg/kg组未见明显改善。ebselen组30 mg/kg则观察到改善作用。SNR各组尼氏染色未见明显差异。 假手术组、模型组、溶剂组、ebselen 10 mg/kg和ebselen 30 mg/kg组大鼠VPN均可观察到8-ohdG表达，其阳性细胞数目(0.1 mm<'2>)分别为108.4．±19.2、140.0±15.4、146.8±12.1、123.6±14.7和123.4±17.4。溶剂组与假手术组比较，差异有显著性意义(P值<0.05)， ebselen 10 mg/kg和ebsel en 30 mg/kg组与溶剂组相比，8-ohdG阳性数目显著下降。SNR的变化趋势类似VPN。 各组大鼠SNR均可观察到OGG1的表达。免疫组化发现OGG1定位于VPN的胞浆和胞核。假手术组、模型组、溶剂组、ebselen 10 mg/kg和ebselen 30 mg/kg组同侧OGGl的阳性细胞数目(0.1mm<'2>)分别为71.4±13.6、23.2±7.3、26.0±9.1、53.8±9.8和58.8±9.4。溶剂组与假手术组比较，差异有显著性意义，ebselen 10 mg/kg和lebselen 30 mg/kg组与溶剂组相比，均为P<0.05。Westernblot证明MCAO后2周同侧VPN OGGl水平显著下降，ebselen组有明显的保护作用，SNR的变化趋势类似VPN。免疫组化发现APE定位于VPN的胞核。组化和Western blot证明MCAO后2周同侧VPN的APE水平显著下降，ebselen组未观察到有明显的保护作用。SNR的APE水平没有明显变化，假手术组、模型组、溶剂组、ebselen 10 mg/kg和ebselen30 mg/kg组的阳性细胞数目(0.1 mm<'2>)分别为80.0±13.2、75.0±14.7、80.4±12.5、71.4±8.9、和72.2±7.6。Western blot证明MCAO后2周同侧VPN的APE水平显著下降，ebselen组未观察到有明显的保护作用，而SNR没有明显变化。 免疫组化和western blot结果显示，MYH在高血压大鼠VPN有大量表达，MCOA两周后，同侧VPN的MYH表达显著降低，ebselen可以明显提高MCAO导致的VPNMYH的降低。而SNR没有明显变化。 结论 实验性大脑皮层梗死后2周，同侧VPN和SNR 8-ohdG水平显著升高，说明VPN和SNR存在DNA氧化性损伤。而同侧VPN的DNA修复酶OGGl，APE和MYH的水平明显下降，同侧SNR的DNA修复酶OGGl水平降低。抗氧化剂ebselen则对DNA氧化损伤有拮抗作用，并可明显升高VPN OGGl和MYH的水平以及SNR的OGGl水平。

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结论

参考文献

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