腺病毒载体介导的可溶性VEGF受体Flt-1（sFlt-1）抑制多发性硬化单核/巨噬细胞浸润的实验研究

摘要

研究背景和目的：多发性硬化(multipiesclerosis，MS)是一种发生中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)的自身免疫性疾病，其特征为脑部出现散在的硬化病灶和斑块，实验性变态反应性脑脊髓炎(experimentalallergicencephalomyelitis，EAE)为MS常用的动物模型，在诸多方面与MS有相似之处。MS常见于年轻女性，是导致年轻人神经功能障碍的主要原因。巨噬细胞介导的髓鞘破坏一直认为是MS和EAE发病的主要作用机制。急性MS病灶一个最明显的标志就是突然出现大量的激活的小胶质细胞和巨噬细胞，在数量上要超过淋巴细胞至少10-20倍，这与出现髓鞘崩解相一致。CNS炎症病灶沿着血管周围分布，伴有T细胞和巨噬细胞浸润，对髓鞘产生损害以及反应性胶质增生。越来越多的证据支持VEGF在MS发病过程中起作用。有些MS病灶病理学改变似缺血改变，可能由于代谢紊乱所致，同时也表现为HIF1α(VEGF转录因子)的表达增加。在动物模型和MS患者血清CNS组织中确实检测到VEGF表达升高。在急性MS和EAE病灶中，文献报道有内皮细胞增生和血管密度增加。在EAE中，VEGF由单核细胞和激活的T细胞表达，与Th1型T细胞表型和炎症严重化相关。 目前已清楚VEGF不仅仅是一个血管生成因子，它不仅对内皮细胞，还对其它类型细胞产生广泛的作用。多种细胞包括星形细胞、神经元、白细胞均产生VEGF及其受体：VEGFR1/Flt-1和VEGFR2。VEGF通过VEGFR1促使单核细胞和T细胞归巢[13-15]，从而诱导多种组织产生炎症，其中包括大鼠脑组织，血脑屏障破坏，MHCI和ICAM-1和MIP-1α表达上调，VEGF可促使星形细胞、小胶质细胞、神经元有丝分裂。 研究表明，体内有可溶性Flt-1(solubleFlt-1，sFlt-1)存在，sFlt-1是Flt-1异常剪接体，不含酪氨酸激酶结合区域，它只含有胞外区的I～VI区，能与膜表面受体Flt-1竞争结合VEGF，并且能与膜表面受体Flt-1及KDR形成同源或异源二聚体，中止活化信号的传递，从而阻断VEGF的生物学活性，因此sFlt-1可能是VEGF体内天然抑制剂。目前国外已有利用sFlt-1进行抑瘤研究的报道，且收效较为显著。 VEGF对单核细胞具有趋化作用，诱导其迁移。单核/巨噬细胞表达：Flt-1，在受到巨噬细胞抗原刺激后表达上调。VEGF的趋化作用认为是通过这一受体实现的。因此，利用VEGF体内天然抑制剂sFlt-1可以在体内封闭MSCNS内升高的VEGF，抑制其对炎症细胞尤其是巨噬细胞的趋化作用，从而达到治疗的目的。 研究方法：1)通过PCR方法扩增sFlt-1(1-3)基因，然后应用腺病毒包装系统构建携带人sFlt-1/FLAG融合基因的重组腺病毒载体(Ad-sFlt-1/FLAG)。应用ELISA、免疫组织化学、免疫荧光化学和Western-blot法检测所构建的重组腺病毒载体在真核细胞中的表达。通过Transwell巨噬细胞趋化实验和Matrigelplug分析，进一步证实重组腺病毒所表达目的的生物学功能；2)选取DA大鼠作为实验动物，应用豚鼠脊髓加完全福氏佐剂制成匀浆诱导EAE模型；3)应用FERIDEXMRI检查监测EAECNS内单核/巨噬细胞的浸润情况；4)通过侧脑室注射Ad-sFlt-1/FLAG阻止EAECNS内单核/巨噬细胞浸润，并通过发病情况、病理改变、免疫组织化学、免疫荧光化学观察，评价治疗效果. 结果：成功构建了Ad-sFlt-1/FLAG，PCR检测证实无野生型腺病毒及腺相关病毒的污染，ELISA、免疫组织化学、免疫荧光化学和Western-blot法检测显示所构建的腺病毒载体携带的基因能够在真核细胞中得到表达。Transwell巨噬细胞趋化实验和Matrigelplug分析显示VEGF对巨噬细胞具有趋化作用，而sFlt-1蛋白具有抑制VEGF对巨噬细胞趋化作用。选择DA大鼠可成功诱导EAE模型，通过常规MRI检查可发现EAE动物模型脑部病灶，FERIDEX增强MRI检查可以监测EAECNS巨噬细胞浸润情况。Ad-sFlt-1/FLAG侧脑室注射组动物发病率为50％，临床评分为2.0±1.00，与侧脑室注射PBS(发病率100％，临床评分3.4±1.07)和Ad-eGFP(发病率87.5％，临床评分3.3±0.97)组相比，差异具有显著性。免疫组化及免疫荧光染色发现EAECNS组织，尤其是脊髓，有大量的VEGF表达细胞，主要为星形胶质细胞，同时有伴有巨噬细胞浸润。Ad-sFlt-1/FLAG侧脑室注射可以抑制EAECNS内单核/巨噬细胞的浸润，从而降低EAE的发病率和改善EAE病情。 结论：本研究成功构建了人sFlt-1基因重组腺病毒(Ad-sFlt-1/FLAG)，并融合FLAG标签；VEGF对巨噬细胞具有趋化作用；可溶性血管内皮生长因子受体Fit-1(sFlt-1)具有抑制VEGF对巨噬细胞趋化的作用；FERIDEX增强MRI检查可以监测EAECNS巨噬细胞浸润情况；EAE动物CNS内VEGF表达增高可能是EAE病情恶化的原因，VEGF在EAECNS内巨噬细胞浸润过程中起着重要作用：Ad-sFlt-1/FLAG侧脑室给药可以抑制CNS内单核/巨噬细胞的浸润，从而降低EAE的发病率和改善EAE病情。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分重组人Ad-sFlt-1/FLAG的构建和鉴定

材料和方法

结果

讨论

第二部分重组人Ad-sFlt-1/FLAG在真核细胞中的表达及其生物学活性

材料和方法

结果

讨论

第三部分重组人Ad-sFlt-1/FLAG对实验性变态反应性脑脊髓炎病灶单核/巨噬细胞浸润的抑制作用

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致 谢

文献综述

综述一 多发性硬化的VEGF表达及血管改变

综述二 超小氧化铁粒子标记免疫细胞在多发性硬化动物模型MR成像中的应用