肿瘤坏死因子抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因转录表达的机制探讨

摘要

背景和目的: 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是肝糖异生的限速酶。内毒素血症性休克时，低血糖的发病机理是炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)抑制PEPCK的表达，且这种抑制作用发生在转录水平。PEPCK基因的转录受多种激素的调控，其中最重要的调节激素是胰高血糖素(通过第二信史cAMP)和胰岛素。转录因子CREB是胰高血糖素诱导PEPCK基因转录所必需的因子，其转录活性受辅激活子的调节，如SRC-1，CBP和TORC2等，但是否存在辅抑制物参与调节CREB的活性仍然未知。有研究报道NF-кB p65能抑制糖皮质激素或cAMP诱导的PEPCK的转录，p65与CBP的相互作用可能介导了p65对PEPCK的抑制。辅抑制物是否亦参与这种相互作用仍有待阐明。因此，为了研究TNF-α抑制作用的分子机制，我们探讨了转录因子CREB、NF-кB p65和辅抑制物如何参与调节肝细胞PEPCK基因的转录。 材料与方法: 1. 细胞模型： 1)大鼠H4IIE肝细胞瘤株和人HepG2肝细胞瘤株作为肝细胞模型； 2. 实验方法： 1)大鼠H4IIE肝细胞株经cAMP和TNF-α处理，观察PEPCK mRNA水平和蛋白水平; 2)用激酶特异性化学抑制剂预处理H4IIE细胞，观察TNF-α抑制PEPCK基因转录所用的信号通路； 3)用人Hep32肝细胞瘤株和人HepG2 sslкBα稳定表达细胞系(能稳定表达超抑制IкBα，即sslKBa，IкBα非降解形式)，进行基因转染，观察sslкBα对PEPCK基因启动子活性(通过报道基因PEPCK-LUC的荧光素酶活性反映)的影响，进一步证实TNF-α抑制PEPCK基因转录的信号通路； 4)大鼠H4IIE和人HepG2 sslкBα~稳定表达细胞系经cAMP和TNF-α处理，观察HDAC3的胞浆和胞核穿梭情况； 5)用HDACs化学抑制物(butyrate，TSA)抑制HDACs活性和RNA干扰技术特异性沉默辅抑制物，研究TNF-α抑制PEPCK基因转录所需辅抑制物： 6)用染色质免疫共沉淀(CHIP)结合实时定量RT-PCR(qRT-PCR)，研究PEPCK基因启动子与转录因子CREB和辅抑制物HDAC3-SMRT的相互作用； 7)用蛋白质免疫电泳检测CREB的磷酸化水平及PGC-1的表达是否受TNF-α的影响； 8)CRE-LUC报道基因瞬时转染于人HepG2细胞株，用RNA干扰技术特异性沉默辅抑制物，研究TNF-α抑制CREB转录活性所需辅抑制物； 9)定点突变PEPCK启动子经典CRE元件(CRE1，-91/-84)(T→G)，检测cAM P和TNF-α,对报道基因活性的影响，证实TNF-α抑制PEPCK基因启动子的作用靶点。 10)为了研究辅抑制物在p65介导的TN F-α对PEPCK基因转录抑制中的作用，人HepG2细胞株和人HepG2 sslкBα稳定表达细胞系瞬时共转染PEPCK-LUC和p65，用RNA干扰技术特异性沉默辅抑制物，观察PEPCK基因启动子活性的改变。 3. 统计学方法：每次试验均重复二三次以上并得出一致的结果。计量资料以均数±标准差描述其特征，两组间比较采用t检验或ANOVA检验，统计处理采用SPSS 10.0 for Windows软件，以双侧P<0.05为有统计学差异的标准。 结果与讨论: 1.TNF-α抑制cAMP介导的PEPCK基因的转录和蛋白表达。 2.阿司匹林和LY294002(两者均能阻断TNF-α对NF-кB的激活)能阻断TNF-α对PEPCK基因转录的抑制作用，提示TNF-α激活IKK/NF-кB通路从而抑制PEPCK表达。 3.表达超抑制IкBα(sslкBα，非降解IкBα)完全阻断TNF-α对PEPCK基因启动子活性的抑制，进一步证实TNF-α对PEPCK基因的抑制作用发生在转录水平，且这种抑制作用依赖于IкBα的降解。 4.TNF-α能诱导HDAC3转位于胞核，同时胞浆中IкBα发生降解。IкBα能控制HDAC3的核转位。IкBα的降解和p65的核转位参与了TNF-α对PEPCK的抑制。 5.HDACs的化学抑制物(butyrate和TSA)能完全阻断TNF-α对PEPCK的抑制。沉默HDAC3或SMRT均能阻断TNF-α对PEPCK的抑制，提示HDAC3和SMRT是参与PEPCK基因转录的辅抑制物，两者形成复合体抑制PEPCK基因转录。 6.染色质免疫共沉淀(CHIP)结果显示cAMP能增强CREB、Pol Ⅱ与PEPCK基因启动子结合，组蛋白乙酰化信号亦增强，同时HDAC3-SMRT与启动子的结合减弱；而TNF-α则与其相反，能减弱CREB、Pol Ⅱ和组蛋白乙酰化信号，同时增强HDAC3-SMRT与PEPCK基因启动子结合。以上彼此相反的结果提示TNF-α能增加辅抑制物的活性，使组蛋白乙酰化减弱，从而降低CREB和Pol Ⅱ的活性。TNF-α使HDAC3-SMRT与PEPCK基因启动子相互作用进而抑制PEPCK转录，CRE1(-91/-84)可能是作用的靶点。 7.TNF-α没有改变CREB蛋白的磷酸化，提示CREB蛋白的磷酸化并不参与TNF-α对PEPCK的抑制。TNF-α亦不能改变PGC-1(CREB的共激活物)的表达，故PGC-1也不参与TNF-α的抑制作用。TNF-α可能通过辅抑制物HDAC3修饰染色质，从而减弱CERB与DNA的结合活性。 8.CREB的转录活性(CRE-LUC报道基因活性)可被TNF-α抑制，而表达sslкBα或沉默HDAC3或SMRT均能阻断TNF-α的抑制作用，提示HDAC3-SMRT复合体通过抑制CREB活性进而抑制PEPCK基因转录。 9.点突变PEPCK基因启动子的CRE2(-91/-84)元件后，cAMP诱导的报道基因的活性比正常减弱50﹪，而TNF-α不能发挥对其的抑制作用，提示CREB是TNF-α抑制PEPCK基因转录所必需的，经典CRE元件(CRE1,-91/-84)是PEPCK启动子上与CREB结合的最主要的位点，亦是TNF-α抑制PEPCK基因转录的靶点。 10.p65共转染抑制PEPCK基因启动子活性，表达sslкB α完全阻断p65对PEPCK基因启动子活性的抑制。而在HepG2 sslкB α稳定表达细胞系，p65共转染不能抑制PEPCK活性。这些数据进一步提示TNF-α的抑制作用依赖于IкBα的降解和NF-кB的核转位。沉默HDAC3或SMRT均能阻断p65对PEPCK的抑制，这一结果提示p65的作用依赖于辅抑制物HDAC3和SMRT。 结论: 1.NF-кB p65介导了TNF-α对PEPCK基因转录的抑制。 2.HDAC3-SM RT复合体是TNF-α抑制PEPCK基因转录的辅抑制物，TNF-α通过激活IKK/NF-кB进而释放辅抑制物HDAC3-SM RT参与抑制CREB介导的PEPCK基因转录。 3.HDAC3-SM RT复合体是CREB的辅抑制物，其参与调节CREB的转录活性从而影响PEPCK基因转录。 4.TNF-α通过抑制CREB的活性进而抑制PEPCK基因转录，经典CRE元件(CRE1，-91/-84)是TNF一0t,发挥抑制作用的靶点。 5.转录因子NF-кB p65和CREB共享相同的辅抑制物HDAC3-SM RT。TNF-α活化NF-кB p65后，HDAC3-SM RT从NF-кB p65移除而被CREB募集并与其结合。NF-кB p65和CREB交换辅抑制物介导了NF-кB p65对PEPCK基因转录的抑制。 综上所述，本研究结果提示NF-кB p85介导了TNF-α对PEPCK基因转录的抑制，这一抑制作用依赖于辅抑制物HDAC3-SMRT的活性，CREB是辅抑制物作用的靶点。我们的研究提出了一个关于辅抑制物如何参与TNF-α对糖代谢调节的新机制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

第一章引言

第二章方法

第三章结果

第四章讨论

第五章结论

附图

参考文献

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致谢

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