线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在黑色素瘤肿瘤再生细胞中的代谢研究

摘要

目的：肿瘤干细胞的存在让肿瘤更具侵袭性、耐药性以及转移性。目前关于肿瘤代谢的研究集中在混合细胞群体的层面，缺乏针对肿瘤干细胞代谢特征以及其分子调控机制的研究。本研究采用三维软蛋白基质胶（3D Fibrin）培养获取的肿瘤再生细胞（TRCs）为模型，探究线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸（PCK2）的表达变化对肿瘤干细胞代谢的影响。
　　方法：（1）RT-PCR和Western blot检测比较小鼠黑色瘤细胞B16-F1、小鼠肝癌细胞H22、人喉癌细胞Hep-2以及人黑色素瘤细胞A875培养获得的TRCs和相应对照细胞中PCK2的表达。RT-PCR和Western blot检测比较小鼠胚胎干细胞（mESCs）在分化与未分化状态下PCK2的表达。流式分选小鼠黑色素瘤细胞B1-F1中CD133+细胞亚群，RT-PCR检测比较CD133+细胞亚群中PCK2的表达。收集两例黑色素瘤临床肿瘤病人标本，分离肿瘤细胞培养获取 TRCs，RT-PCR检测两例病人标本TRCs中PCK2的表达。（2）检索TCGA数据库并分析PCK2的表达与肿瘤病人生存期是否相关。（3）构建PCK2过表达质粒载体，转染B16-F1 TRCs，6小时后再将其尾静脉接种小鼠，24天后观察小鼠肺部成瘤情况；B16-F1细胞转染PCK2 siRNA，6小时后再将其尾静脉接种小鼠，24天后观察小鼠肺部成瘤情况；构建PCK2 Tet-On细胞株，将其种入3D fibrin胶中，在添加或不添加多西环素的情况下，比较克隆大小和数目，并比较TRCs对顺铂的敏感性。将PCK2 Tet-On细胞株，接种到小鼠皮下，分别用添加或不添加多西环素（Dox）的水喂养，比较该细胞在小鼠皮下的成瘤能力。（4）分析比较 B16-F1 TRCs和B16-F1葡萄糖消耗以及乳酸释放量；过表达PCK2，比较B16-F1 TRCs葡萄糖消耗和乳酸释放量；比较B16-F1 TRCs和对照细胞TCA循环中间物柠檬酸的含量；过表达PCK2，检测B16-F1 TRCs柠檬酸的含量变化；siRNA沉默异柠檬酸脱氢酶IDH3A以及苹果酸脱氢酶MDH2，观察B16-F1 TRCs和对照细胞的生长情况并检测其葡萄糖消耗；siRNA沉默柠檬酸转运蛋白 SLC25A1、柠檬酸裂解酶ACLY、脂肪酸合酶FASN以及苹果酸酶ME1，检测B16-F1 TRCs葡萄糖消耗；比较 B16-F1 TRCs和对照细胞 TCA循环代谢中间产物延胡索酸的含量；过表PCK2，检测B16-F1 TRCs中延胡索酸含量变化；Western blot检测B16-F1 TRCs和对照细胞中 HIF1α和 HIF2α的表达；调控 PCK2表达后，Western blot检测B16-F1 TRCs中HIF1α和HIF2α的表达；用质谱检测比较B16-F1 TRCs和对照细胞中 DNA的5羟甲基胞嘧啶和5甲基胞嘧啶的含量；过表达 PCK2，检测B16-F1 TRCs DNA中5羟甲基胞嘧啶和5甲基胞嘧啶的含量变化；Seahorse XF24设备检测比较B16-F1 TRCs和对照细胞的耗氧量水平；过表达PCK2后，检测B16-F1 TRCs耗氧量变化；不同浓度的电子传递链复合物I抑制剂（Rotenone）、复合物V抑制剂寡霉素（Oligomycin）分别处理B16-F1 TRCs和对照细胞，用CCK-8试剂盒检测比较细胞增殖情况，并检测葡萄糖消耗量。
　　结果：（1）B16-F1细胞、H22细胞、Hep-2细胞和A875细胞TRCs相对于普通肿瘤细胞，PCK2呈下调表达。mESC处于未分化状态时低表达PCK2。PCK2在B16-F1 CD133+细胞亚群中的表达低于 CD133-细胞亚群。两例黑色瘤病人标本TRCs中PCK2呈低表达。（2）PCK2的表达与黑色素瘤、肺癌和胃癌病人的总生存期相关。（3）B16-F1 TRCs过表达PCK2后，在小鼠肺部形成转移斑点数目减少；B16-F1转染siRNA沉默PCK2后，在小鼠肺部形成转移斑点数目增多；将PCK2 Tet-On稳定细胞株种入3D fibrin中，在添加多西环素培养下，形成克隆的体积变小、数目减少，并且对顺铂敏感性变差。PCK2 Tet-On稳定细胞株接种小鼠皮下，多西环素喂养组小鼠成瘤能力减弱。（4）与B16-F1相比，B16-F1 TRCs葡萄糖消耗增多，乳酸释放量增多；过表达PCK2后，B16-F1 TRCs葡萄糖消耗减少，乳酸产生量降低；B16-F1 TRCs柠檬酸的含量增高；过表达PCK2后，B16-F1 TRCs中柠檬酸的含量减少；B16-F1 TRCs沉默异柠檬酸脱氢酶IDH3A以及苹果酸脱氢酶2后，克隆生长没有明显变化，葡萄糖消耗也没有明显差异，而B16-F1细胞生长明显受抑制，葡萄糖消耗减少；沉默柠檬酸转运蛋白SLC25A1、柠檬酸裂解酶ACLY、脂肪酸合酶FASN以及苹果酸酶ME1，B16-F1 TRCs葡萄糖消耗明显减少；B16-F1 TRCs中延胡索酸含量增多；过表达PCK2后，B16-F1 TRCs中延胡索酸含量降低；在缺氧的情况下，B16-F1 TRCs中HIF蛋白的表达升高；过表达PCK2后，B16-F1 TRCs中HIF蛋白表达降低；B16-F1 TRCs细胞DNA的5-羟甲基化程度降低；过表达PCK2后，B16-F1 TRCs中DNA的5-羟甲基化程度增高；B16-F1 TRCs细胞耗氧量降低；过表达PCK2后，B16-F1 TRCs耗氧量增高；与 B16-F1细胞相比，电子传递链抑制剂 Rotenone和 Oligomycin对B16-F1 TRCs细胞的抑制作用更差。
　　结论：肿瘤再生细胞相对于对照细胞下调表达 PCK2，PCK2低表达对维持肿瘤再生细胞的生长和成瘤至关重要，而且PCK2的表达与肿瘤病人的总生存期密切相关。过表达PCK2后，B16-F1 TRCs细胞体外生长受抑制，体内致瘤能力减弱。B16-F1 TRCs糖酵解能力增强，氧化磷酸化水平降低。B16-F1 TRCs下调表达PCK2，发挥的生物学效应的内在机制可能是：①生成更多的柠檬酸，用于合成脂肪酸；②中间代谢物延胡索酸含量增高，进而影响缺氧诱导因子的表达，对细胞糖酵解产生影响；③中间代谢物延胡索酸含量增高，进而影响DNA羟甲基化程度，维持细胞的未分化状态；④降低细胞氧化磷酸化的水平，减少氧消耗。这些发现揭示PCK2的下调表达是黑色素肿瘤再生细胞重要的代谢标志，在其代谢过程中发挥重要调节作用，有望作为黑色素瘤治疗的靶标。

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缩略词表

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前言

第一部分 肿瘤再生细胞中PCK2表达下调

1 材料与方法

2 结果

3讨论

第二部分 PCK2下调促进肿瘤再生细胞生长以及成瘤性

1 材料与方法

2结果

3讨论

第三部分 肿瘤再生细胞PCK2表达下调的机制研究

1 材料与方法

2结果

3 讨论

总结与讨论

参考文献

综述: 肿瘤干细胞的研究进展

致谢

附录1：攻读期间发表论文与获奖情况

附录2：实验中所使用的主要仪器设备