尖锐湿疣组织中LTBP-1和TGF-βRⅡ mRNA的表达及其意义

摘要

尖锐湿疣(CA)是人乳头瘤病毒(HPV)感染人生殖器官及附近表皮引起的皮肤粘膜良性增生性疾病，是临床上最常见的性传播疾病(STD)之一，具有易复发，发病率逐年上升等特点。HPV是一种无包膜的双链DNA病毒。已发现的HPV亚型中至少有30余种与CA相关。根据这些亚型诱发癌变的危险性大小可将其分为低危型(如HPV6，11)，中危型和高危型(如HPV16，18)三类。HPV只感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，不产生病毒血症。迄今为止，HPV既不能在组织细胞中进行培养，亦没有建立理想的动物模型。临床上，尚无有效的抗病毒制剂可供应用，疫苗研究也未获突破性进展，现行治疗不能针对HPV的亚临床感染和潜伏感染，且多为有创治疗，疼痛大而复发率高；皮损长期的反复发作以及各种治疗方法的不断刺激尚可能诱发癌变。有关CA疣体的发生，发展，复发以及恶变的机理仍不十分清楚。如何有效抑制疣体形成，减少复发，一直是困扰我们的难题，而进一步阐明尖锐湿疣的发病机理显然是解决这一问题的关键。 免疫学方面，目前普遍认为，尖锐湿疣患者皮损局部及全身均不同程度存在着免疫功能的紊乱，尤其是细胞免疫功能的受抑，使得HPV得以逃脱机体的免疫监视，难以被清除。从分子生物学的角度来看，上皮细胞的生长、增殖、分化、凋亡甚至转化及恶变；局部血管的生成以及细胞外基质的形成等因素均与尖锐湿疣疣体的发生密切相关。尖锐湿疣就是一种仅累及皮肤和粘膜的良性肿瘤。已有研究证明，很多参与肿瘤形成的相关因子、基因及其产物也可能参与尖锐湿疣的发生、发展。如HSP70，原癌基因(c-myc、c-fos及ras等)，癌基因产物TGF-α，核因子NF-к b，凋亡抑制基因Bcl-2，抑癌基因p53、p16等均与病毒感染角质形成细胞的过度增殖甚至癌变密切相关；VEGF则参与CA皮损中毛细血管的增多和扩张。最近引起人们广泛关注的转化生长因子β(TGF-β s)是一种多功能的细胞因子，广泛参与调控细胞周期、血细胞生成、细胞分化、血管生成、免疫反应、诱导凋亡以及细胞外基质(ECM)的生成等多个生理或病理过程。对表皮而言，它是一种有效的上皮细胞生长抑制因子，在维持表皮内环境稳定、参与上皮组织肿瘤的发生和发展中起着重要作用。潜在转化生长因子β结合蛋白(LTBP)与TGF-β的合成、分泌、储存及活化密切相关，活化TGF-β s必须通过受体(TGF-β R)的介导才能启动下游信号转导。多种Smads蛋白是介导TGF-β s信号从膜表面受体传递到细胞核内的效应分子或调节分子。已发现多种良恶性肿瘤，特别是上皮源性的肿瘤，存在TGF-β s的表达，活化或信号转导通路的异常。例如，研究显示，基底细胞上皮瘤、鳞癌中TGF-β 1过度表达，而TGF-β R则表达下调；前列腺癌中LTBP-1表达下调甚至缺失；脂溢性角化中TGF-β R表达下调等；此外，非肿瘤性皮肤病如银屑病皮损中TGF-β 1及其受体的表达也是下调的。那么，对于尖锐湿疣这种表皮良性肿瘤，TGF-β s及其信号通路的各种组分在尖锐湿疣瘤体的发生，发展甚至恶变中起着什么样的作用呢?国内外诸多研究业已证明，CA皮损中TGF-β 1的表达水平是确定上调的，但他们大多数仅仅从免疫的角度单纯阐述TGF β 1作为一种负调控因子在CA的免疫学发病机理中所起的作用，很少全面关注它的其他功能，更没有深入探讨其活化及信号转导通路对CA发病的影响。我们的研究采用荧光定量PCR技术同时检测TGF-β 1活化及信号转导通路中的两个关键蛋白：LTBP-1和TGF-β 1的Ⅱ型受体(TGF-β RⅡ)的mRNA在尖锐湿疣皮损中的表达，从分子生物学的多个角度进一步完善CA瘤体的发生、发展甚至恶变的机理，为寻求新的治疗靶点和进行恶变的预测提供新的思路和理论依据。国内外尚未见相关文献的报道。 研究目的: 1．检测CA组织中LTBP 1和TGF β R Ⅱ mRNA表达水平，探讨TGF-β 1活化及信号转导通路中的这两个关键蛋白与尖锐湿疣发生、发展的关系，从分子生物学角度进一步完善尖锐湿疣的发病机理，为CA的治疗和预后提供新的策略、思路及理论依据。 2．比较不同病程的患者CA组织LTBP-1和TGF-β RⅡ mRNA表达水平，探讨病程与TGF-β 1信号通路关键因子表达水平的关系及其意义。 材料与方法: 研究对象： 病例组标本取自我院皮肤科门诊CA患者30例；男24例，女6例；平均年龄33.7岁；平均病程4.1月，据病程长短，又将病例组分为短病程组(≤3月)17例，长病程组(≥6月)7例；临床皮损典型，皮疹直径≥0.5厘米，醋酸白试验(+)，病理证实，排除现症感染，自身免疫性疾病，病毒性肝炎，结核，糖尿病等。对照组：我院外科门诊包皮环切术患者17例，平均年龄23.5岁，排除以上疾病。病例组每份标本取出后均立即分成两份，一份置于10﹪甲醛磷酸缓冲液中固定后常规脱水、透明并石蜡包埋；另一份立即放入液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。对照组标本则直接液氮速冻后-80℃保存。 用哺乳动物RNA抽提方法，提取尖锐湿疣组织或包皮组织总RNA，用紫外分光光度计分别测定并计算所提RNA的OD<,260>/OD<,280>比值，检验其纯度并计算RNA浓度。取RNA水溶液5μl进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在紫外光透射下观察电泳条带，检测其完整性。参照逆转录试剂盒说明进行操作合成cDNA，于-20℃保存备用。 按照荧光定量PCR引物设计原则分别设计LTBP-1，TGF-β RⅡ以及内参18S rRNA的引物，首次进行荧光定量PCR(SYBR Green Ⅰ法)实验须验证目的基因和内参基因的扩增效率是否一致，以决定能否采用2<'-△△Ct>法对所得数据进行分析。 方法为梯度稀释同一份模板cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明进行加样和条件的设定，设置熔解曲线以验证产物的特异性，将反应产物经琼脂糖凝胶电泳再次确认其单一性，计算△Ct=Ct<,(目的基因)>-Ct<,(内参基因)>，以稀释度为横坐标，△Ct为纵坐标，得出斜率分别为0.094(LTBP-1与18s rRNA比较)和0.090(TGF-β RⅡ与18s rRNA比较)，由于当斜率<0.1时视为扩增效率近似相等，故可以采用2<'-△△Ct>法进行数据的分析，即：△△Ct=△Ct<,(正常组)>-△Ct<,(病例组)>，差别倍数=2<'-△△Ct>，差别倍数大于2即说明差别显著。正式实验后cDNA毋须稀释，余操作方式同前，每管重复3次。结果取其平均值。实验数据用SDS2.0软件(ABI)获取和分析。 结果: 1．病例组CA皮损中LTBP-1， TGF-β RⅡ mRNA表达水平均明显降低，与对照组包皮组织比较，二者差异有统计学意义。 2．病例组中短病程组(≥6个月)与长病程组(≤3个月)比较，LTBP-1在两组间的表达无统计学差异；而TGF-β R Ⅱ mRNA在长病程组中的表达水平则明显降低，两组间差异有统计学意义。 结论: 1．TGF-β活化及信号通路中关键因子：LTBP-1和TGF-β RⅡ的异常与尖锐湿疣的发生、发展甚至恶变密切相关。 2．CA组织中LTBP-1的表达不受病程长短的影响；而TGF-β RⅡ的表达随病程的延长而更低。 3．针对TGF-β活化及信号通路中关键因子的治疗策略具一定的应用潜力和空间。 4．TGF-β RⅡ可作为判断CA预后(复发、恶变)的指标之一。 5．qRT-PCR(SYBR Green Ⅰ法)具快速、灵敏、重复性高、可相对定量、结果可靠和PCR产物污染小等优点，可用此法对各类基因的mRNA和DNA进行定量测定。是检测局部组织细胞因子mRNA表达的理想方法之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

第1章前言

1研究背景及目的

2研究内容

3研究意义

第2章材料与方法

1研究对象

2主要实验试剂

3主要仪器设备

4实验步骤

实验步骤流程图

第3章结果

第4章讨论

第5章结论

参考文献

附 图

致 谢