体内表达法合成siRNA靶向神经干细胞BACE1基因治疗阿尔茨海默病的实验研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimet's disease，AD)是一种发生于中枢神经系统的进行性退行性疾病，β淀粉样蛋白(Amyloid β，Aβ)的沉积是AD病变的始发因素和中心环节，对抗Aβ的形成、沉积及毒性作用是治疗AD的根本策略。开发有效的针对Aβ代谢的关键酶--β-分泌酶(Beta-site App CleavingEnzyme，BACE1)的抑制剂是AD研究领域的新热点。在AD患者或是动物模型脑内，大量神经元持续破坏的情况下，并没有大量神经元再生，AD发生的过程可认为是内源性神经未能顺利再生的过程。基因工程和干细胞移植的研究，给生命科学带来了重大的变革。机体使NSC进入细胞循环，并诱导其增殖、分化，产生各种神经细胞替代缺损的细胞，是一种非常有潜力的修复神经系统细胞损伤的手段。NSC具有Aβ损伤区的自主追踪性，移植后的NSC能被特异性吸引到脑内神经退行性变区域；然而高浓度的Aβ对神经干细胞却有较强的抑制作用。因此，使AD患者脑部内环境中的Aβ含量降低至一定水平对于治疗AD是及其必要的。随着RNA干扰(RNA interfererice，RNAi)技术的发展和应用，获得高纯度、特异性的siRNA的方法从体外转录法发展到体内表达法，本实验利用体内表达法下调神经干细胞中：BACE1基因的表达量，使降低脑内Aβ的浓度成为可能；鉴于神经元难于转染的特性，下调了BACE1基因的神经干细胞也可用于诱导并分化为低表达BACE1基因的神经元。这也就是本研究的目的与意义所在。 实验目的： 在前期对AD和RNA干扰研究的基础之上，采用新的siRNA合成技术----体内表达法，探讨RNAi技术在神经干细胞中特异性下调BACE1的效果，为利用RNAi技术靶向BACE1基因治疗AD研究的进一步开展提供重要资料。 材料与方法： 1.构建能够在细胞内采用体内表达生成siRNA的shRNA表达载体用于RNAi实验。构建表达载体的基本步骤是：针对靶基因设计3条干扰片段，设计无关序列的对照作为阴性对照。合成相应的发夹状插入DNA片段，并将插入片段连接入pSilenCircle预切质粒。该质粒使用基于RNA的U6聚合酶Ⅲ启动子和优的终止子，从而在靶细胞内启动小RNA的转录。 2.以C17.2小鼠神经干细胞系为实验对象，将不同质量外源GFP质粒转染进C17.2细胞，观察质粒质量对细胞转染率的影响。评价GFP质粒单独转染时的剂量--转染率关系，分析对于该细胞系最适合的转染的质粒质量。 3.以C17.2小鼠神经干细胞系为实验对象，将3种重组干扰质粒和pGFP-C1质粒共同转染进C17.2细胞系。转染后在荧光显微镜下观察不同实验组GFP的表达情况。于干扰后48h提取细胞总RNA，采用realtime-PCR检测不同干扰位点BACE1 mRNA的表达水平。筛选出干扰效率最高的重组质粒。 4.以C17.2小鼠神经干细胞系为实验对象，将筛选出最有效重组干扰质粒转染进C17.2细胞系。于干扰后3d、5d、7d提取细胞总RNA，采用realtime-PCR检测BACE1 mRNA的表达水平。 5.提取新生昆明种小鼠海马部位神经干细胞并培养鉴定。干扰其BACE1基因并于干扰后3d、5d、7d提取细胞总RNA，采用Realtime-PCR检测BACE1 mRNA的表达水平。 结果： 1.构建了能够在细胞内产生有效靶向BACE1基因的siRNA的表达载体。 2.外源GFP质粒可被成功转染进C17.2细胞内，并有效表达。荧光可在转染后8小时或更早观测到。通过实验估算了使转染效率最高的适宜的质粒质量。 3.体内表达法合成的siRNA有效的抑制了C17.2神经干细胞系BACE1基因的表达。siRNA对BACE1的抑制效应与靶位点的选择及干扰位点有关。干扰后选择不同时间点进行检测，干扰效果在较长时间内可保持恒定。 4.成功提取了新生昆明种小鼠海马部位的原代神经干细胞并进行了鉴定。 5.体内表达法合成的siRNA有效的抑制了原代神经干细胞内BACE1基因的表达，干扰效果亦可持续较长时间。 结论： 1．首次自行设计合成了针对BACE1基因的RAN干扰片段，成功构建了RNA干扰质粒重组体。该重组体可以利用体内表达合成法合成siRNA，避免了目前多采用的体外转录、化学合成等方法对细胞毒性较大的弊端。重组体通过感受态菌体转化等方法可大规模合成，为大范围、高通量进行RNA干扰研究提供了一种理想的siRNA合成方法。 2．成功将表达型质粒pEGFP-Cl利用脂质体转染入C17.2神经干细胞系。该质粒可在细胞内表达外源性GFP基因。随着pEGFP-Cl质粒转染剂量的增加，转染效率先升高后降低，提示转染质粒的剂量是保证转染效率的必要条件。在C17.2细胞中转染最佳剂量该质粒后，转染效率>90﹪，外源基因GFP表达持续时间>84小时，为使用RNA干扰质粒重组体高效转染C17.2神经干细胞并在其内持续表达靶向BACEl基因的siRNA提供了理论依据。 3．利用体内表达法针对BACE1基因，将质粒重组体和pEGFP-Cl质粒共转染C17.2神经干细胞，成功抑制了其中内源性BACE1基因的表达，抑制作用呈现出位点效应和时间效应。通过检测成功筛选出一条灵敏度高特异性强的靶向：BACE1基因的siRNA序列，其重组体干扰效果可达7天以上。提示RNA干扰后C17.2神经干细胞可作为基因治疗AD的理想的细胞株。 4．从新生昆明种小鼠海马组织细胞中成功提取了原代神经干细胞，经体外培养分裂增殖成由数百个细胞组成的神经球。Nestin免疫荧光染色证实神经干细胞纯度高，GFAP和β-tublin免疫荧光染色证实神经干细胞具有向神经胶质细胞和神经元分化的潜能。 5．将质粒重组体和pEGFP-Cl质粒共转染原代神经干细胞，质粒重组体对神经球无明显的毒性作用，并显示出对原代神经干细胞内源性BACE1基因具有明显的抑制效率，干扰7天后仍可见抑制作用。结果进一步提示利用RNA干扰修饰的基因工程化神经干细胞可作为下调内源性BACEI治疗AD的有效方法。

目录

文摘

英文文摘

前言

1.1阿尔茨海默病的病因及研究现状

1.2神经干细胞研究进展

1.3 RNAi的原理及其应用

1.4本课题的研究目的与意义

材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

结果

3.1特异性靶向BACE1基因的干扰片段表达载体构建

3.2 C17.2神经干细胞系的培养与鉴定

3.3 pEGFP-C1质粒质量与转染率分析

3.4利用C17.2细胞筛选最有效的干扰片段

3.5表达载体下调BACE1基因的时效性检测

3.6小鼠海马神经干细胞的提取、培养和鉴定

3.7干扰质粒与pEGFP-C1共转染原代神经干细胞

讨论

4.1体内表达法是合成siRNA的理想方法

4.2 BACE1基因是治疗AD的理想靶点

4.3 RNAi是抑制BACE1基因表达治疗AD的理想方法

4.4 RNAi基因修饰的NSCs是AD极具潜力的基因治疗方法

结论

参考文献

缩略词

致谢

原创性声明