公开/公告号CN113082209A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-09
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学技术大学;
申请/专利号CN202110346276.5
申请日2021-03-31
分类号A61K45/00(20060101);A61K48/00(20060101);A61K31/713(20060101);A61K31/166(20060101);A61K31/397(20060101);A61K31/443(20060101);A61P25/28(20060101);G01N33/68(20060101);
代理机构11021 中科专利商标代理有限责任公司;
代理人高丽娜;张莹
地址 230026 安徽省合肥市包河区金寨路96号
入库时间 2023-06-19 11:49:09
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及CD4
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是最常见的神经退行性疾病,也是最主要的痴呆类型,主要表现为认知和记忆功能障碍。尽管越来越多的证据表明AD病理从中年就开始沉积在大脑中,但临床上的病理症状一般发生在65岁之后。随着全球人口老龄化日趋严重,65岁人口的增长比例显著提升,导致AD的发生迅速增加。流行病学研究预测:从1997 年到2050年,65岁以上老龄人口将全球化增长,其中美洲从6300万增长到1.37亿、非洲从1800万增长到3.8亿、欧洲从1.13亿增长到1.7亿、亚洲则从1.72亿增长到4.35亿。60-64岁的人群中痴呆发病率不到1%,但是,随着年龄的增长,其发病率呈指数型增长,尤其是西方国家85岁以上人群的发病率将达到24%-33%。目前,AD具体病因仍然未知,对于 AD仍缺乏有效的治疗手段。
BACE1(β-site APP cleaving enzyme,β分泌酶)属于天冬氨酸蛋白酶家族,在脑内主要表达于神经元,它是由501个氨基酸构成的I型天冬氨酸蛋白酶,具有两个天冬氨酸蛋白酶活性位点基序,包括DTGS和DSGT,并且其中任意一个发生突变都将使BACE1失活。β-淀粉样蛋白(Amyloid-β peptide,Aβ)包括Aβ40和Aβ42沉积形成的淀粉样斑块是AD最显著的病理性特征之一,基于此而提出的淀粉样蛋白假说认为Aβ的异常沉积是导致AD发生的主要原因。而Aβ的产生正是由神经元中的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)经过BACE1和γ-分泌酶依次剪切导致。因此,BACE1被视为AD治疗的靶标之一,以BACE1作为AD治疗靶点的临床实验越来越受到关注,但至今为止,几乎所有相关的临床实验都宣告失败了,其中一个可能原因就是该疗法为广谱性而非特异性的靶向抑制BACE1,从而导致了潜在的副作用和风险。
研究表明,BACE1同样在外周CD4
CD4
传统的观点认为中枢神经系统是免疫豁免部位,但越来越多的证据表明,T细胞参与中枢神经系统的免疫监视。研究表明,健康个体的脑脊液 (Cerebrospinal fluid,CSF)中大概有150000个淋巴细胞,并且每天会在血液中更新两次之后再次进入CSF。CSF中超过80%的T细胞是CD4
神经炎症是促进AD发生发展的重要因素,尽管大家普遍认为AD中的神经炎症是由小胶质细胞和星形胶质细胞介导的,但现在研究显示,T 细胞至少可以通过两个方面参与调节AD中的炎症反应。首先,在AD发展期间,由于血管内皮细胞中紧密连接分子ZO-1和Occludin的表达下降,血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)的通透性将逐渐增加,以及随着趋化因子受体CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2等在外周CD4
截至目前,尚未有研究结果证实CD4
发明内容
为解决现有技术中的不足,本发明的发明人首次发现CD4
为此,本发明第一方面提供CD4
在本发明的实施方式中,所述药物至少包括使CD4
在本发明的一些实施方式中,所述使CD4
在本发明的一些实施方式中,所述CD4
在本发明的另一些实施方式中,所述BACE1蛋白的抑制剂为β-分泌酶抑制剂IV(BIV),所述EP2抑制剂为PF-04418948,所述EP4抑制剂为BGC-20-153。
本发明第二方面提供治疗或缓解阿尔茨海默病的药物,其中,所述药物包括活性成分和/或药学上可接受的载体,所述活性成分为使CD4
在本发明的一些实施方式中,所述使CD4
在本发明的一些实施方式中,所述“药学上可接受的载体”通常在所采用的剂量和浓度下对受体无毒,包括但不限于:缓冲液,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六烃季铵;苯扎氯铵;苄索氯铵;苯酚,丁醇或苄醇;烷基对羟基苯甲酸酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚(乙烯基吡咯烷酮);氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇;成盐的反离子,诸如钠;金属复合物(例如锌蛋白复合物);和/或非离子表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。
本发明第三方面提供CD4
在本发明的一些实施方式中,所述试剂或试剂盒至少包括使CD4
在本发明的另一些实施方式中,所述使CD4
本发明第四方面提供治疗或缓解阿尔茨海默病的试剂或试剂盒,其中,所述试剂或试剂盒至少包括使CD4
在本发明的一些实施方式中,所述使CD4
在本发明的一些实施方式中,所述CD4
本发明第五方面提供使CD4
本发明第六方面提供阿尔茨海默病生物标志物,其特征在于,所述生物标志物包括CD4
本发明第七方面提供诊断阿尔茨海默病的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括CD4
本发明第八方面提供治疗或缓解阿尔茨海默病的方法,其包括向受试者施用治疗有效量的上述药物组合物、试剂或试剂盒。
发明人前期研究发现CD4
本发明的有益效果在于:
本发明首次发现CD4
附图说明
以下将结合图具体说明本发明。
图1:BACE1特异性剪切mPGES2而不剪切mPGES1的Western blot 结果图;
图2:BACE1-siRNA抑制BACE1剪切mPGES2的Western blot结果图;
图3:CRISPR-Cas9 BACE1 KO(knockout)细胞内剪切mPGES2的 Western blot结果图;
图4:BACE1抑制剂BIV抑制小鼠CD4
图5:BACE 1
图6:HUBC来源的CD4
图7:CD4
图8:CD4
图9:WT小鼠和BACE 1
图10:WT小鼠和HUBC小鼠来源CD4
图11:WT小鼠和BACE 1
图12:WT小鼠和HUBC小鼠来源CD4
图13:WT小鼠和BACE 1
图14:WT小鼠腹腔注射PGE2后24h,CD4
图15:WT小鼠和BACE 1
图16:WT小鼠和HUBC小鼠来源CD4
图17:WT小鼠和BACE 1
图18:WT小鼠和BACE 1
图19:CD4
图20:WT小鼠和BACE 1
图21:WT小鼠和HUBC小鼠来源CD4
图22:WT小鼠和BACE 1
图23:WT小鼠和HUB小鼠来源CD4
图24:WT小鼠和BACE 1
图25:WT小鼠和BACE 1
图26:WT小鼠和BACE 1
图27:WT小鼠和BACE 1
图28:WT小鼠和HUBC小鼠皮下注射KLH 7d后,脾脏CD4
图29:WT小鼠和HUBC小鼠皮下注射KLH 7d后,脾脏CD4
图30:WT小鼠和HUBC小鼠皮下注射KLH 7d后,血清中KLH抗体IgM和IgG的Elisa结果统计图;
图31:WT小鼠和HUBC小鼠皮下注射KLH 7d后,对脾细胞体外 KLH刺激48h后,培养基中IL-2的Elisa结果统计图;
图32:WT小鼠和BACE 1
图33:WT小鼠和BACE 1
图34:WT小鼠和BACE 1
图35:WT小鼠和BACE 1
图36:WT小鼠和BACE 1
图37:WT小鼠和BACE 1
图38:AD患者外周CD4
图39:AD患者外周血CD4
图40:AD小鼠外周CD4
图41:AD小鼠外周血Naive CD4
图42:AD小鼠外周血CD4
图43:AD小鼠给药PGE2受体EP2/EP4拮抗剂7d后,脑内病理的组织化学染色图;
图44:AD小鼠给药PGE2受体EP2/EP4拮抗剂7d后,在CD3/CD28 抗体刺激下CD4
具体实施方式
以下通过具体的实施例说明本发明的技术方案。然而,这些实施例仅用于举例说明的目的,并不意味着本发明的范围限于此。
下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中使用的实验材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1 BACE1特异性剪切mPGES2前体形式
1.实验过程
为证实BACE1与mPGES2之间的关系,本发明构建了稳定转染 HA-BACE1和Flag-mPGES2质粒的HEK293细胞,用蛋白质免疫印迹法 (Western blot)技术检测mPGES2的前体形式(分子量为43kDa)和成熟形式(分子量为34kDa)的变化情况(附图1)。同时,为证实BACE1对mPGES2的调控是特异性的,我们还构建了另一个前列腺素合成酶 mPGES1(GFP-mPGES1质粒)和BACE1质粒稳定表达的HEK293细胞,也进行了Western blot的检测(附图1)。另一方面,本发明利用siRNA和 CRISPR-Cas9技术构建了稳定的BACE1敲低(knockdown)和敲除(KO,knockout)细胞系,在此细胞系里转染Flag-mPGES2质粒,用Western blot 技术检测mPGES2的前体形式(分子量为43kDa)和成熟形式(分子量为 34kDa)的变化情况(参见附图2和3)。
2.实验材料
HEK293细胞,细胞培养试剂均购买于GIBICO(Carlsbad,CA); Flag-mPGES2(EX-Mm35377-M35,Genecopoeia)、 GFP-mPGES1(EX-V0007-M98,Genecopoeia),HA-PKH3(货号:12555) 购买于Addgene;siRNA购买于GenePharma;
抗体如下:
一抗:anti-BACE1(5606S,CST);anti-GFP(66002,proteintech); anti-Flag(F1804,sigma);anti-Actin(60008,proteintech)。
二抗:Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjugate(W4011,promega); Anti-MouseIgG(H+L),HRP Conjugate(W4021,promega)。
核苷酸序列:
si-BACE1:5’-GCATGATCATTGGAGGTATTT-3’;
si-control(作为si-BACE1的阴性对照): 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;
CRISPR-Cas9 BACE1 knockout sgRNA序列:5’- GGATCCGGAGCCCGCTACAT-3,(sgBACE1-1)
3.具体操作
在本研究中用到的细胞均培养于含有2mM L-谷氨酸,10%FBS,100 μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中,培养条件为37℃, 5%CO
(1)HA-BACE1质粒的构建:利用BACE1(Gene ID为23621)的cDNA和购买的HA-PKH3构建HA-BACE1;
(2)利用CRISPR-Cas9技术得到BACE1 knockout HEK293细胞系;
(3)HEK293细胞共转染BACE1和mPGES2或mPGES1实验:①对照组:HEK293细胞共转染HA-PKH3和Flag-mPGES2;实验组:HEK293 细胞共转染HA-BACE1和Flag-mPGES2。②对照组:HEK293细胞共转染 HA-PKH3和GFP-mPGES1;实验组:HEK293细胞共转染HA-BACE1和GFP-mPGES1。
(4)HEK293细胞si-RNA敲低BACE1对mPGES2表达的影响实验:由于HEK293本身表达mPGES2较低,因此对其si-RNA处理时,同时转染Flag-mPGES2,其中对照组:转染Flag-mPGES2+si-control;实验组:转染Flag-mPGES2+si-BACE1。
(5)HEK293细胞CRISPR-Cas9技术敲除BACE1对mPGES2表达的影响实验:采用已建立的BACE1 knockout HEK293细胞系(实验组),和正常的HEK293细胞(对照组)分别转染Flag-mPGES2。
以上细胞样品用细胞裂解液1%Nonidet P-40(11332473001,Roche), 0.5%去氧胆酸钠(89905,Thermo),1M Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5,蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche))裂解收集;于常温裂解细胞,然后加入等体积2×SDS电泳上样缓冲液。沸水中煮样10min制成SDS电泳样品。
用蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测mPGES2的前体形式(分子量为43kDa)和成熟形式(分子量为34kDa)的变化情况。
蛋白免疫印迹法操作方法:
SDS-PAGE电泳:根据所需蛋白的大小配制合适浓度的SDS电泳凝胶,待测样品等量上样后进行电泳分离(上层浓缩胶恒压80伏特,下层分离胶恒压120伏特);
转膜:SDS-PAGE电泳完成后进行转膜(PVDF膜用甲醇激活3min后使用),240安培恒流按蛋白大小转膜不同时间(约90-180min),转膜过程在冰水浴中进行;
封闭:转膜完成后,将载有蛋白的膜置于TBST缓冲液配置的5%脱脂牛奶中,摇床室温封闭1小时;
一抗孵育:根据蛋白抗体的使用说明或预实验结果,配制合适浓度的一抗,封闭后的转移膜室温孵育3小时后,转移至4℃过夜;
洗涤一抗:用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次,每次10min;
二抗孵育:用一抗相对应的二抗室温摇床孵育膜90min;
洗涤二抗:用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次,每次5min;
显色检验:膜上的蛋白含量信号用ECL显影试剂盒进行显色检测。
4.结果分析
由附图1结果可知,mPGES2的前体形式(分子量43kDa)可被BACE1 特异性剪切为成熟形式(分子量为34kDa)。
由附图2结果可知,敲低BACE1的蛋白表达水平,可减弱BACE1 对mPGES2的前体形式(分子量43kDa)的剪切(p<0.05)。
由附图3结果可知,敲除BACE1的蛋白表达水平,可减弱BACE1 对mPGES2的前体形式(分子量43kDa)的剪切(p<0.05)。
实施例2 CD4
1.实验过程
为探究CD4
2.实验材料
BACE 1
BACE1抑制剂(β-分泌酶抑制剂IV)具体信息如下:
别名:BACE抑制剂C3
CAS号:797035-11-1
经验分子式(希尔表示法):C
分子量578.72
结构式:
抗体如下:
一抗:anti-BACE1(5606S,CST);anti-GAPDH(60004,proteintech); anti-Actin(60008,proteintech);anti-mPGES2(成熟形式34kDa)(10881, proteintech);anti-PTGES2(前体形式43kDa)(sc-514224,santa);PE anti-mouse CD4(100512,Bioledgend)。
二抗:Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjugate(W4011,promega); Anti-MouseIgG(H+L),HRP Conjugate(W4021,promega);Alexa Fluor 488- 抗兔IgG(H+L)(A27034,Invitrogen)。
3.具体操作
在本研究中用到的细胞均培养于含有10%FBS,100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中,培养条件为37℃,5%CO
(1)CD4+T细胞的分选:1)小鼠脾脏或淋巴结分离得到单个核细胞后,300μl MACsbuffer重悬细胞沉淀,加入5μl PE-anti mouse CD4流式抗体+45μl大鼠血清,4℃避光孵育30min,加入10ml 1×PBS终止染色,500g,4℃,离心8min;2)弃上清,350μl MACs buffer重悬细胞沉淀,加入20μl anti-PE磁珠,4℃避光孵育30min,加入10ml 1×PBS 终止孵育,500g,4℃,离心8min;3)弃上清,500μl MACs buffer重悬细胞沉淀,200目尼龙网过滤,弃杂质;4)将MS分选柱固定于分选架上,500μl MACs buffer润洗分选柱,待液滴完全流出后,加入细胞重悬液;5)待液滴完全流出后,加入500μl MACs buffer洗两遍;6)待液滴完全流出后,将分选柱转移至盛有1ml MACs buffer的15ml离心管上,加入1ml MACs buffer迅速冲洗下分选柱上结合的细胞,500g,4℃,离心8min;7)适量体积1×PBS或1640培养基重悬细胞。
(2)检测BACE 1
以上细胞样品用细胞裂解液(1%Nonidet P-40,0.5%去氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate),1M Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5,蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche))裂解收集;于常温裂解细胞,然后加入等体积2×SDS 电泳上样缓冲液。沸水中煮样10min制成SDS电泳样品。
用Western blot技术检测BACE1,具体操作方法同实施例1。
(3)CD4
以上细胞样品用细胞裂解液(1%Nonidet P-40,0.5%去氧胆酸钠 (sodiumdeoxycholate),1M Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5,蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche))裂解收集;于常温裂解细胞,然后加入等体积2×SDS 电泳上样缓冲液。沸水中煮样10min制成SDS电泳样品。
用Western blot技术检测mPGES2前体形式和成熟形式,具体操作方法同实施例1。
(4)CD4
用流式细胞术检测BACE1表达情况。具体方法如下:
1)得到细胞悬液后,调整细胞浓度,取100μl约1×10
(4)CD4
以上细胞样品用细胞裂解液(1%Nonidet P-40,0.5%去氧胆酸钠 (sodiumdeoxycholate),1M Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5,蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche))裂解收集;于常温裂解细胞,然后加入等体积2×SDS 电泳上样缓冲液。沸水中煮样10min制成SDS电泳样品。
用Western blot技术检测BACE1的表达,具体操作方法同实施例1。
(5)CD4
以上细胞样品用细胞裂解液(1%Nonidet P-40,0.5%去氧胆酸钠 (sodiumdeoxycholate),1M Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5,蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche))裂解收集;于常温裂解细胞,然后加入等体积2×SDS 电泳上样缓冲液。沸水中煮样10min制成SDS电泳样品。
用Western blot技术检测mPGES2成熟形式的表达,具体操作方法同实施例1。
(6)CD4
以上细胞培养基从-80℃取出,解冻,用于酶联免疫吸附试验(ELISA) 技术检测PGE2的含量。具体方法如下:
1)按照说明书配制相应溶液及标准品,所有溶液恢复至室温后使用 (下述所有试剂都包含在所购买的ELISA kit中)。
2)加入100μl ELISA buffer至NSB孔,50μl ELISA buffer至B0孔。
3)加入50μl PGE2 monoclonal antibody至孔(除了TA孔、NSB孔和 Blk孔),室温孵育1h。
4)加入不同浓度梯度标准品及待测样品50μl至其余孔中,加入50μl PGE2 AchETracer孔中(除了TA孔和Blk孔),4℃孵育过夜。
5)倾去板中液体,用wash buffer洗5遍。
6)每孔加入200μl Ellman’s Reagent,加入5μl PGE2 AchE Tracer至 TA孔,避光,室温孵育60-90min。
7)酶标仪410nm读数,制作标准曲线,计算样品PGE2浓度。
(7)CD4
上述细胞使用Trizol(每个样品加入1ml)处理后,交付测序公司进行RNA-Seq实验。之后对数据进行分析,统计PGE2不同受体的表达情况。
4.结果分析
由附图4结果可知,BACE 1
由附图5结果可知,HUBC小鼠的CD4
由附图6结果可知,CD4
由附图7结果可知,随着CD4
由附图8结果可知,随着CD4
由附图9结果可知,CD4
由附图10结果可知,CD4
由附图11结果可知,CD4
由附图12结果可知,CD4
由附图13结果可知,CD4
实施例3 BACE1通过PGE2调控CD4
1.实验过程
为探究BACE1是否调控CD4
2.实验材料
BACE 1
抗体如下:
一抗:anti-Actin(60008,proteintech);T Cell Signaling Antibody SamplerKit(14541,CST);Anti-IκBα(4814,CST)Anti-p-IκBα(9246S, CST);Anti-Iκκβ(11930,CST);Anti-p-Iκκβ(2697,CST);anti-p38(8690, CST);anti-p-p38(4511,CST);anti-p-AKT(4060,CST);anti-AKT(4685, CST);anti-ZAP(3165,CST);anti-Src(2109,CST);anti-LAT(9166,CST); PE anti-mouse CD4(100512,Bioledgend)。
二抗:Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjugate(W4011,promega); Anti-MouseIgG(H+L),HRP Conjugate(W4021,promega);Goat Anti-Armenian hamster(IgG)(ab5738,Abcam)。
3.具体操作
(1)PGE2促进CD4
CD4
1)500μl预冷1×PBS(具有0.5%BSA)重悬,加入anti-CD3/anti-CD28(终浓度:1μg/ml),冰上孵育15min;
2)加入500μl 1×PBS(具有0.5%BSA),终止孵育,微型台式离心机 6500rpm,2min,离心,弃上清;
3)取相同细胞数(2×10
4)EP管置于37℃水浴,加入Goat anti-hamsterIg(40μg/ml)或等体积 1×PBS刺激,10min后加入1×SDS中止刺激,并95℃煮沸10min制成 SDS电泳样品。
用Western blot技术检测TCR通路相关蛋白变化,具体操作方法同实施例1。
(2)CD4
分离得到的CD4
用Western blot技术检测TCR通路相关蛋白变化,具体操作方法同实施例1。
(3)CD4
分离得到的CD4
用Western blot技术检测TCR通路相关蛋白变化,具体操作方法同实施例1。
4.结果分析
由附图14结果可知,PGE2能够促进CD4
由附图15结果可知,CD4
由附图16结果可知,CD4
实施例4 BACE1促进CD4
1.实验过程
TCR通路是CD4
2.实验材料
BACE 1
抗体如下:
一抗:FITC anti-mouse Ki-67(652410,Bioledgend);PE anti-mouse CD4(100512,Bioledgend);Pacific Blue
3.具体操作
在本研究中用到的细胞均培养于含有10%FBS,100μg/ml青霉素和 100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中,培养条件为37℃,5%CO
(1)CD4
上述细胞收集后培养24h,之后收集细胞细胞用流式细胞术检测增殖性标记物Ki-67的表达量,流式细胞术具体方法同实施例2。
(2)CD4
上述细胞收集后,加入CD3/CD28抗体(1μg/ml)或1×PBS培养24h,收集细胞培养液用ELISA方法检测IL-2的含量。具体方法如下:
按照说明书配制相应溶液及标准品(下述所有试剂都包含于ELISA kit 中),所有溶液恢复至室温后使用。
1)加入100μl不同浓度梯度标准品及待测样品至孔中。
2)加入50μl Biotinlated antibody至孔中,37℃,孵育90min。
3)倾去板中液体,用wash buffer洗5遍。
4)加入100μl Streptavidin-HRP至孔中,37℃,孵育90min。
5)倾去板中液体,用wash buffer洗5遍。
6)加入100μl TMB,避光,37℃,孵育5-30min。
7)根据孔内颜色深浅,加入100μl Stop solution终止反应。
8)酶标仪450nm、610nm读数,制作标准曲线,计算样品IL-2浓度。
(3)CD4
上述细胞收集后,加入CD3/CD28抗体(1μg/ml)或1×PBS培养24h,之后收集细胞用流式细胞术检测CD69的表达。流式细胞术具体方法同实施例2。
4.结果分析
由附图17结果可知,CD4
由附图18结果可知,CD4
由附图19结果可知,CD4
由附图20结果可知,CD4
由附图21结果可知,CD4
实施例5 BACE1促进CD4
1.实验过程
为探究BACE1是否同样调控CD4
2.实验材料
BACE 1
抗体如下:
一抗:Biotin anti-IgM(406504,Bioledgend);Biotin anti-IgG(53441, BD),FITC anti-mouse Ki-67(652410,Bioledgend);PE anti-mouse C D4(100512,Bioledgend);Pacific Blue
3.具体操作
在本研究中用到的细胞均培养于含有10%FBS,100μg/ml青霉素和 100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中,培养条件为37℃,5%CO
(1)BACE1敲除抑制ConA诱导的CD4
流式细胞术具体方法同实施例2。
(2)BACE1过表达促进ConA诱导的CD4
流式细胞术具体方法同实施例2。
(3)BACE1敲除抑制(过表达则促进)KLH诱导的CD4
用流式细胞术检测脾脏CD4
用ELISA技术检测脾脏细胞体外继续KLH刺激48h后,培养基中IL-2 的表达量,具体方法同实施例4。
用ELISA技术检测小鼠血清中KLH特异性抗体IgG和IgM的效价。具体方法如下:
1)配制碳酸缓冲液:1.59g Na
2)抗原包被:实验前一天,将KLH用碳酸盐缓冲液稀释至10μg/ml (抗原浓度可根据检测需要而定),加入100μl至每孔,4℃过夜(一般16 h左右)。
3)PBST(0.05%Tween)洗,300μl×3次。
4)加入300μl 1%BSA(PBS配制)封闭非特异性结合,室温2h。
5)PBST(0.05%Tween)洗,300μl×3次。
6)向第一孔中加入200倍稀释(可调整)的血清样品,酶标板纵向往下每孔稀释2倍,混匀,37℃,孵育1h。
7)PBST(0.05%Tween)洗,300μl×3次。
8)Anti-mouse IgG及IgM抗体用PBST 1:2000稀释,加入100μl至每孔,37℃,孵育1h。
9)PBST(0.05%Tween)洗,300μl×3次。
10)加入100μl HRP-labeled streptavidin(1:10000)至每孔,室温,孵育30min。
11)PBST(0.05%Tween)洗,300μl×3次。
12)加入100μl TMB底物,需提前拿出恢复至室温使用,避光,室温, 15min。
13)酶标仪检测450nm读数,计算抗体效价。
(4)CD4
1)小鼠脾脏或淋巴结分离得到单个核细胞后,1×10
2)封闭及抗体孵育:加入50μl大鼠血清+50μl isolation Cocktail至细胞悬液中,使用移液枪混匀,室温孵育7.5min。
3)加入50μl deleption Cocktail至细胞悬液中,使用移液枪混匀,室温孵育2.5min。
4)振荡RapidSpheres 30sec,取75μl加入至细胞悬液中,使用移液枪混匀,室温孵育2.5min。
5)加入1.5ml 1640培养基细胞悬液中,使用移液枪混匀,转移流式管至磁极,室温孵育2.5min。
6)将流式管内细胞悬液倾倒入15ml离心管中(流式管连同磁极整体倾倒),500g,4℃,离心8min,弃上清,加入适量1640培养基重悬待用。
上述分离得到的CD4
4.结果分析
由附图22结果可知,BACE1敲除后,ConA非特异性诱导的CD4
由附图23结果可知,BACE1过表达后,ConA非特异性诱导的CD4
由附图24结果可知,BACE1敲除后,KLH特异性诱导的CD4
由附图25结果可知,BACE1敲除后,KLH特异性诱导的CD4
由附图26结果可知,BACE1敲除后,KLH特异性诱导的CD4
由附图27结果可知,BACE1敲除后,KLH特异性诱导的CD4
由附图28结果可知,BACE1过表达后,KLH特异性诱导的CD4
由附图29结果可知,BACE1过表达后,KLH特异性诱导的CD4
由附图30结果可知,BACE1过表达后,KLH特异性诱导的CD4
由附图31结果可知,BACE1过表达后,KLH特异性诱导的CD4
由图32结果可知,CD4
由图33结果可知,CD4
由图34结果可知,CD4
由图35结果可知,CD4
由图36结果可知,CD4
由图37结果可知,CD4
实施例6 AD患者及AD模型小鼠CD4
1.实验过程
已有的研究表明AD患者脑内及外周血中的BACE1表达显著升高,但CD4
2.实验材料
AD患者及认知正常对照的外周血来源于中国科学技术大学附属第一医院神经内科;5×FAD来源于Jackson Laboratories。细胞分选试剂Anti-PE beads(130-048-801,Miltenyi Biotec);20×磷酸盐缓冲生理盐水(20×PBS, 工作液用蒸馏水稀释至50倍至1×使用)购自Sangon公司;HISTOPAQUE (10771),购自Sigma公司。
抗体如下:
一抗:PE anti-mouse CD4(100512,Bioledgend);Pacific Blue
二抗:Anti-Rabbit IgG(H
3.具体操作
在本研究中用到的细胞分选试剂MACs buffer:即磁珠分选缓冲液, 1×PBS中含2mM EDTA,0.5%牛血清白蛋白。
(1)AD患者外周血中CD4
1)5ml血液,直接配平离心,2000rpm,10min,取上清(血浆),蛋白低吸附EP管分装200μl/管,转移至-80℃保存。
2)去除上层血浆之后,加入2ml 1640培养基重悬;
3)15ml离心管加入3ml HISTOPAQUE密度梯度分离液(提前恢复至室温后使用),倾斜离心管(45°),将2ml细胞重悬沿管壁缓慢加入到分离液上层,400g,室温,离心20min,升6降0。
4)移液枪小心吸出中间白色细胞层(单个核细胞)至盛有8ml 1640 培养基的新15ml离心管中,300g,室温,离心5min。
5)弃上清,加入2ml 1640培养基重悬沉淀,300g,室温,离心5min。
6)弃上清,用500-1000μl细胞冻存液(90%FBS+10%DMSO)重悬细胞,转移到细胞冻存管,做好标记,放入程序冻存盒,次日转移至液氮罐中保存。
以上部分细胞样品用细胞裂解液(1%Nonidet P-40,0.5%去氧胆酸钠 (sodiumdeoxycholate),1M Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5,蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche))裂解收集;于常温裂解细胞,然后加入等体积2×SDS 电泳上样缓冲液。沸水中煮样10min制成SDS电泳样品。
用Western blot技术检测BACE1的表达,具体操作方法同实施例1
同时以上部分细胞样品用流式细胞术检测CD4
(2)AD模型小鼠脾脏中CD4
以上部分细胞样品用细胞裂解液(1%Nonidet P-40,0.5%去氧胆酸钠 (sodiumdeoxycholate),1M Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5,蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche))裂解收集;于常温裂解细胞,然后加入等体积2×SDS 电泳上样缓冲液。沸水中煮样10min制成SDS电泳样品。
用Western blot技术检测BACE1的表达,具体操作方法同实施例1
同时以上部分细胞样品用流式细胞术检测CD4
4.结果分析
由附图38结果可知,AD患者外周血中CD4
由附图39结果可知,AD患者外周血中CD4
由附图40结果可知,AD模型小鼠脾脏中CD4
由附图41结果可知,AD模型小鼠脾脏中CD4
由附图42结果可知,AD模型小鼠脾脏中CD4
实施例7 PGE2受体EP2/EP4抑制剂处理显著改善AD模型小鼠脑内病理
1.实验过程
以上实施例实验表明BACE1可通过剪切mPGES2前体形式,促进 mPGES2的成熟,从而促进PGE2的产生,进一步上调CD4
2.实验材料
5×FAD来源于Jackson Laboratories。细胞分选试剂Anti-PE beads (130-048-801,Miltenyi Biotec);20×磷酸盐缓冲生理盐水(20×PBS,工作液用蒸馏水稀释至50倍至1×使用)购自Sangon公司;EP2抑制剂 (PF-04418948,可特异性的结合EP2,从而抑制PGE2与EP2结合)购自MCE公司;EP4抑制剂(BGC 20-1531,可特异性的结合EP4,从而抑制PGE2与EP4结合)购自Absin公司;VECTASTAIN Elite ABC Kit Components及DABPeroxidase Substrate Kit均购自Vector公司。
EP2抑制剂具体信息如下:
别名:1-(4-氟苯甲酰基)-3-[[((6-甲氧基-2-萘基)氧基]甲基]-3- 氮杂环丁烷羧酸
CAS号:1078166-57-0
经验分子式(希尔表示法):C
分子量409.41
结构式:
EP4抑制剂具体信息如下:
别名:4-[[4-(5-甲氧基-2-吡啶基)苯氧基]甲基]-5-甲基-N-[((2-甲基苯基)磺酰基]-2-呋喃甲酰胺
CAS号:1186532-61-5
经验分子式(希尔表示法):C
分子量492.5
结构式:
抗体如下:
一抗:PE anti-mouse CD4(100512,Bioledgend);T Cell Signaling A ntibodySampler Kit(14541,CST);Anti-β-Amyloid,17-24(800711,Bi oledgend);Anti-Iba1(019-19741,WAKO)。
二抗:Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjugate(W4011,promega);A nti-MouseIgG(H+L),HRP Conjugate(W4021,promega);Biotinylated H orse Anti-Rabbit IgG(BA-1100,Vector);Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG(BA-2000,Vector)。
3.具体操作
(1)PGE2受体EP2/EP4抑制剂改善AD小鼠脑内病理的实验:4月龄5×FAD小鼠分为A-D共四组,其中A组连续7天灌胃PBS;B组连续 7天灌胃PF-04418948,62.5mg/kg/day;C组连续7天灌胃BGC 20-1531, 62.5mg/kg/day;D组连续7天灌胃PF-04418948(62.5mg/kg/day)及BGC 20-1531(62.5mg/kg/day)。7天后,取小鼠脑子冰冻切片,并保存于-80℃用于免疫组化实验,具体方法如下:
1)-80℃冰箱取出脑片、室温2h。
2)漂洗:用1×PBS进行漂洗3次,每次5min。目的是清除冰冻切片是所用的OCT包埋剂。
3)封闭内源性过氧化物酶:组织中存在内源性过氧化物酶会与显色剂发生反应造成假阳性结果,用甲醇作为溶剂配制而成的0.3%H
4)漂洗:1×PBS进行漂洗3次,每次5min,以避免实际交叉反应。
5)抗原修复:柠檬酸修复液配制(A液:21.01g柠檬酸+1L ddH2O; B液:29.41g柠檬酸钠(2H2O)+1L ddH
6)采用水浴热修复技术,将切片放入装满修复液的小烧杯中,再将烧杯放入装有水的大烧杯中,保鲜膜封口(扎几个小口通气)置于微波炉内。高档烧至冒泡---中档8min(强度以加热时冒泡停止时不冒泡为准)---微波炉内冷却10min---室温自然冷却(大概20-30min)。
7)漂洗:1×PBS进行漂洗3次,每次5min。
8)可选择:切片用88%甲酸,室温孵育20min。1×PBS进行漂洗3 次,每次5min。
9)细胞通透:用1×PBS配制0.3%Ttiton X-100,室温孵育30min。
10)漂洗:漂洗:1×PBS进行漂洗3次,每次5min。
11)封闭:10%山羊血清,PBS配制)或10%马血清,PBS配制),37℃孵育20min。
12)一抗孵育:轻轻甩干并用滤纸擦拭切片周围多余的血清封闭液,加入一抗,室温1h,4℃孵育过夜。
13)复温:一抗4℃过夜后先放入室温孵育20min,目的是为了防止切片从4℃直接放入1×PBS漂洗导致脱片。
14)漂洗:漂洗:1×PBS进行漂洗3次,每次5min。
15)二抗孵育:轻轻甩干并用滤纸擦拭切片周围多余的血清封闭液,加入生物素标记二抗,37℃孵育30min(二抗用vector kit,10%山羊血清 1:2000稀释)。并配制ABC复合物,必须静置反应30min左右。
16)漂洗:1×PBS进行漂洗3次,每次5min。
17)ABC孵育:轻轻甩干并用滤纸擦拭切片,滴加ABC复合物(1%山羊血清10μl A液和10μl B液,AB混合液即为C,因此合称ABC)
18)漂洗:2次,每次10min.
19)显色:滴加DAB显色液(1ml DAB液+16.8μl缓冲液+16μl H
20)苏木精复染,返蓝。
21)脱水透明:75%酒精——85%酒精——95%酒精——无水乙醇1——无水乙醇2(第一缸无水乙醇可能被上一缸95%酒精稀释,为彻底脱水,需要过两缸无水乙醇)——二甲苯1——二甲苯2(第一缸二甲苯可能被上一缸无水乙醇稀释,为彻底透明,需要过两缸二甲苯),各3min。
22)封片:在二甲苯干之前滴入中性树胶封片,通风处晾干,用酒精擦拭周边。
23)全自动倒置荧光显微镜拍照
(2)PGE2受体EP2/EP4抑制剂改善AD小鼠CD4
用Western blot技术检测TCR通路蛋白的表达,具体操作方法同实施例1。
4.结果分析
由附图43结果可知,EP2/EP4抑制剂处理能够显著改善AD小鼠脑内病理,表现为AD小鼠脑内Aβ沉积减少,及小胶质细胞激活减弱(p<0.05)。
由如图44结果可知,EP2/EP4抑制剂处理能够显著改善AD小鼠CD4
综上所述,CD4
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述,但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改,以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
机译: 筛选能够与cd4结合的分子,产生治疗性组合物,筛选能够与cd4结合的抗体或抗体片段,体外生产用于激活cd4调节性t细胞+ cd25 +的抗体或抗体片段的方法用于治疗个体并筛选样品,治疗组合物,抗体或抗体片段,分离的肽,分离的肽模拟表位,核酸,载体,宿主细胞或杂交瘤中是否存在cd4 + cd25 +调节细胞抗体或抗体片段,分离的肽和cd4 + cd25 +调节性t细胞,cd4 + cd25 +调节性t细胞和试剂盒。
机译: 筛选能够与cd4结合的分子,产生治疗性组合物,筛选抗体或抗体片段,体外活化cd4 + cd25 +调节性t细胞,治疗个体以及筛选cd4的方法样品中的+ cd25 +调节细胞,治疗组合物,抗体或抗体片段,分离的肽,分离的肽模拟表位,核酸,载体,宿主细胞或杂交瘤,分离的肽的抗体或抗体片段和cd4 + cd25的用途+调节性t细胞,cd4 + cd25 +调节性t细胞和试剂盒。
机译: 能够激活cd4 + cd25 +调节性t细胞的人源化抗cd4抗体及其在制备用于治疗或预防免疫疾病的组合物中的用途