近年来的研究提示糖尿病血管合并症与高血糖有着密切关系，慢性高血糖是一个重要的启动因子，在糖尿病血管合并症的发生和发展过程中起着重要作用。如果糖尿病患者血糖控制不好，高血糖本身即可以通过多种中间产物和下游底物诱导细胞功能障碍，则可诱发改变血管的结构和功能的分子机制。高血糖致糖尿病慢性合并症的分子机制是蛋白激酶C活性增强、晚期糖化终产物的产生、氧化应激增强和多元醇通路增强。提示高血糖本身即可通过产生有毒的活性产物或者改变细胞内的信号通路而导致血管内皮细胞或中膜平滑肌细胞的功能障碍。 研究发现，糖尿病或高血糖状态下多种细胞的钙泵活性发生变化，并且认为其在糖尿病及其并发症的发生发展中起重要作用。 血管平滑肌细胞胞浆Ca<'2+>浓度升高是引起血管收缩的关键环节。在作为血管舒缩活动中心环节的细胞内Ca<'2+>的调节过程中，质膜钙泵(plasma membraneCa<'2+>ATPase，PMCA)和肌浆网钙泵(sarco/endoplasmic reticulum Ca<'2+>ATPase，SERCA)起着重要作用。细胞通过PMCA，SERCA和钠钙交换(Na<'+>．Ca<'2+>exchange，NCX)将胞内游离钙泵出胞外或泵入肌浆网，以降低胞内游离钙离子浓度。钙泵对维持细胞内钙平衡、保证细胞正常的结构和生理功能起了重要作用。目前认为在主动脉平滑肌细胞上起对钙缓冲(calcium buffering)起主要作用的钙泵是PMCA(约占40﹪)和SERCA(约占42﹪)，而NCX所起作用较少(仅占18﹪)，意义不大。 彩色多普勒超声(color Doppler ultrasound)对糖尿病发病时期主动脉血管的观察分辨率、清晰度好，重复性强，并且可同时获得血管结构和血流动力学方面的动态监测数据，对评价大血管弹性、顺应性有较高的价值，同时也可以明确大动脉是否有狭窄，狭窄部位和狭窄程度。 目前对于糖尿病大血管病变机制的研究中，细胞内Ca<'2+>调控紊乱占有多大角色尚未明确；同时也未见有关糖尿病时期血管平滑肌细胞钙泵活性的变化以及糖尿病发病过程中大鼠血流动力学变化的报道。本实验首次通过测定糖尿病大鼠发病不同时期主动脉平滑肌细胞SERCA和PMCA活性以及利用彩色多普勒技术测定主动脉血管结构及血流动力学的变化情况，初步探讨钙泵活性变化与血流动力学变化之间的联系以及对糖尿病大血管病变产生和发展的影响。 第一部分糖尿病发病过程中大鼠主动脉平滑肌细胞钙泵活性的变化新鲜分离4，8，12，16周糖尿病大鼠与同时期正常大鼠主动脉，用密度梯度离心方法分离肌浆网蛋白、膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白，Ca2+ATPase试剂盒分别测定SERCA和PMCA活性，观察糖尿病发病的不同时期主动脉平滑肌细胞钙泵活性的变化。结果显示： 1.Wistar雄性大鼠，体重为215g±15 g(n=96)，随机分为正常对照组和糖尿病模型组。建立糖尿病模型72小时后，糖尿病组血糖明显升高(糖尿病组：26.9±0.5 mmol·L<'-1>vs正常组：5.1±0.6 mmol·L<'-1>，n=48 from each group，P<0.001)；4，8，12，16周糖尿病组血糖较同期对照组均明显升高(n=12 fromeach group，P<0.001)；4，8，12，16周糖尿病组体重较同期对照组均明显降低(n=12 from each group，P<0.001)，并明显出现多饮、多食、多尿和生长迟缓等症状。 2.密度梯度离心方法提取肌浆网蛋白浓度的鉴定：大鼠主动脉肌浆网蛋白制备与主动脉中层平滑肌组织匀浆相比，肌浆网标志酶葡萄糖-6-磷酸酶活性分别为(15.24±2.95)和(1.62±0.57)μmolPi·mg<'-1>protein·h<'-1>(n=8，P<0.01)，前者为后者9.4倍；细胞膜标志酶Na<'+>K<'+>-ATPase活性分别为(2.29±0.96)和(11.07±2.75)μmolPi·mg<'-1>protein·h<'-1>(n=8，P<0.01)，后者为前者4.8倍。 3.糖尿病造模成功后4，8，12，16周主动脉平滑肌细胞SERCA活性与同时期对照组SERCA活性的测定：4周糖尿病大鼠SERCA活性为(1.99±0.17)μmolPi·mg<'-1> protein·h<'-1>，与同期对照组(2.11±0.22)μmolPi·mg<'-1> protein·h<'-1>相比没有显著差异。8周、12周、16周糖尿病大鼠SERCA活性分别为(1.79±0.12)、(1.71±0.20)、(1.60±0.18)μmolPi·mg<'-1> protein·h<'-1>，与正常对照组SERCA活性(2.11±0.24)、(2.12±0.20)、(2.11±0.27)μmolPi·mg<'-1>protein·h<'-1>相比有显著差异(n=6 each group，P<0.05)。 4.糖尿病造模成功后4，8，12，16周主动脉平滑肌细胞PMCA活性与同期对照组PMCA活性的测定：4周糖尿病大鼠PMCA活性为(3.54±0.13)μmolPi·mg<'-1> protein·h<'-1>较同期对照组(3.27±0.12)μmolPi·mg<'-1>protein·h<'-1>升高(n=6，P<0.05)，但8周糖尿病大鼠PMCA活性为(3.06±0.27)μmolPi·mg<'-1>protein·h<'-1>与同期对照组(3.06±0.27)μmolPi·mg<'-1>protein·h<'-1>相比没有明显差异，12、16周糖尿病大鼠PMCA活性分别为(2.83±0.17)、(2.54±0.33)μmolPi·mg<'-1>protein·h<'-1>，较同期对照组(3.33±0.29)、(3.13±0.20)μmolPi·mg<'-1>protein·h<'-1>明显降低(n=6 each group，P<0.05)。 第二部分糖尿病发病过程中大鼠主动脉血管结构以及血流动力学变化本实验通过彩色超声多普勒测定糖尿病大鼠发病过程中4，8，12，16周主动脉血管内径、内膜-中膜厚度以及血流动力学参数。结果显示： 1.糖尿病4、8、12、16周大鼠主动脉血管内径分别为(1.90±0.08)mm、(1.70±0.22)mm、(1.83±0.15)mm、(1.83±0.15)mm；同期对照组主动脉血管内径分别为(1.98±0.13)mm、(2.00±0.22)mm、(1.95±0.13)mm、(1.98±0.13)mm，其中12、16周主动脉血管内径有明显差异(n=6 each group，P<0.05)。 2.糖尿病4、8、12、16周大鼠主动脉内膜-中膜厚度分别为(0.40±0.05)mm、(0.43±0.05)mm、(0.46±0.05)mm、(0.46±0.03)mm；同期对照组主动脉内膜-中膜厚度分别为(0.39±0.03)mm、(0.38±0.06)mm、(0.40±0.04)mm、(0.39±0.05)mm；随着糖尿病病程逐渐延长，呈逐渐增加趋势，且16周有显著差异(n=6 each group，P<0.05)。 3.糖尿病4、8、12、16周大鼠主动脉血流动力学参数：4、8、12、16周糖尿病大鼠主动脉搏动指数(PI)和阻力指数(RI)与同期对照组相比均显著增加(n=6 from each group，P<0.05，respectively)：而最大血流速度(Vp)和平均血流动速度(Vm)均显著降低(n=6 from each group，P<0.05，respectively)；加速度(ACC)较对照组显著降低(n=6 from each group，P<0.05，respectively)：其中12、16周糖尿病组Vp、Vm较同期对照组减缓2.5倍以上。 小结： 1.糖尿病发病过程中大鼠主动脉平滑肌细胞胞内钙缓冲能力降低；PMCA活性在4周代偿性升高，但随病程延长，PMCA活性又逐渐降低；SERCA活性在糖尿病随着病程延长逐渐降低；其机制可能与糖尿病时期各种损害因素有关。 2．随着糖尿病病程的延长，大鼠主动脉血管内径逐渐减小，血管壁逐渐增厚；糖尿病中晚期主动脉血管壁已发生明显的血管重构。 3．糖尿病发病过程中，血流搏动指数、阻力指数逐渐增加；峰值血流速度、平均血流速度逐渐减小，加速度逐渐减小；提示血管弹性减弱、血管顺应性下降、血液粘滞度增加、动脉血液流速降低、肢体远端血流供应减少。 4．糖尿病发病过程中，特别是疾病发展的中后期，SERCA和PMCA活性的变化与血流动力学的改变有明显的相关性，即钙泵活性的改变参与了血管平滑肌细胞内Ca<'2+>调控机制的紊乱，与糖尿病大血管病变的产生和发展密切相关。
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