TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达及其对缺氧性神经损伤保护作用的初步研究

摘要

缺血性脑卒中是威胁人类健康和生命以及影响生存质量的重要疾病。近些年来人们发现，急性脑缺血时缺血中心的神经元就会死亡，而周围的缺血半暗带，即位于梗死中心具有潜在活力的缺血组织，大多数神经元都能存活稍长时间。半暗带内的神经元大多数存在功能障碍，不能维持所有的正常功能，但是如果及时给予治疗能够得到挽救。梗死组织的终体积取决于缺血半暗带。因此，缺血半暗带组织是临床上积极治疗争取的最关键的目标，如果早期给予足够的干预可以逆转损伤。研究表明，凋亡是缺血半暗带内细胞主要的死亡方式。在有效时间窗内挽救缺血半暗带脑组织，抑制神经元凋亡的发生可减轻脑缺血缺氧性损伤。神经元凋亡的过程中，线粒体损伤发生线粒体凋亡是最为关键的一步，实现线粒体保护阻止线粒体凋亡可减轻神经元凋亡的发生。Ngb是一种脊椎动物中枢神经系统特异性携氧球蛋白，目前认为其功能可能是促进氧向神经元中的线粒体扩散，或直接介导氧向线粒体的传递，有助于ATP的产生，从而对正常神经细胞功能的维持起重要作用。已有资料表明，Ngb对缺血缺氧性脑损伤有保护作用，但其神经保护机制不明。生物膜和血脑屏障的存在，限制了大分子多肽和蛋白进入细胞和脑组织，而通过病毒载体、脂质体等转基因技术引导大分子物质进入细胞内的操作因其存在的许多问题限制了应用。TAT PTD介导的蛋白转导技术可以快速高效地将目的蛋白转运入靶细胞，并可穿透血脑屏障进入脑组织，为将目的蛋白及时运送至脑内发挥作用提供了新的思路。在以上研究的基础上，本实验选择抑制线粒体途径的神经元凋亡为靶点，在原核表达系统内表达并纯化出可溶性TATPTD-Ngb融合蛋白，分析对神经元的跨膜转导活性及其透过血脑屏障的能力，分别在体外和体内观察其对缺氧诱导的神经元损伤的作用，为探索Ngb的脑保护机制及缺血缺氧性脑保护的新途径提供实验基础。 第一章可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化。 目的：构建含HIV-1 TATPTD与脑红蛋白融合基因的表达质粒，原核表达可溶性PTD-Ngb，并鉴定、纯化。 方法: 提取SD大鼠脑组织总RNA，通过RT-PCR法构建编码PTD-Ngb的融合基因及Ngb对照基因，经测序正确后分别克隆入pET28b(+)原核表达载体，构建重组表达质粒：pET-PN与pET-Ngb，转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及可溶性鉴定，并将可溶性表达产物在天然条件下用Ni-NTA琼脂进行亲和层析纯化。 结果: 成功扩增序列完全正确的TAT PTD-Ngb融合基因，片段长500 bp，成功构建了含有PTD-Ngb的原核表达载体，成功表达并纯化了可溶性PTD-Ngb融合蛋白，分子量约为20 ku，Westem blot鉴定显示表达蛋白与标记抗体具有良好免疫，且纯化后的融合蛋白纯度可达95﹪以上。 结论: 可溶性融合蛋白TAT、PTD-Ngb的表达和纯化对进一步研究Ngb的功能及蛋白转导技术的应用奠定了基础。 第二章TAT PTD-Ngb融合蛋白在大鼠原代皮质神经元的转导。 目的：对TAT PTD-Ngb穿透大鼠原代培养的皮质神经元胞膜的能力进行鉴定，观察其转导活性和转导特点。 方法: 取新生大鼠皮质，采用Neurobasal+B27的无血清培养方法，培养原代皮质神经元，用神经元特异性标记MAP-2细胞免疫荧光法鉴定神经元纯度。取终浓度分别为0．1、0.5、1.0、2.0μM TAT PTD-Ngb蛋白加入培养的皮质神经元中，37℃孵育2h后，Western blot分析神经元内TAT PTD-Ngb含量。取终浓度2.0μMTAT PTD-Ngb蛋白加入培养的皮质神经元中，37℃分别孵育15min，30min，1h，2h，4h，8h，Western blot分析神经元内TAT PTD-Ngb含量，同时，用细胞免疫荧光法观察进入神经元内的TAT PTD-Ngb。取终浓度2.0μM TATPTD-Ngb蛋白加入培养的皮质神经元中，37℃孵育2h后，更换培养基，分别在24h，48h，72h收集细胞，Westem blot分析神经元内TAT PTD-Ngb含量。 结果: 原代培养的大鼠皮质神经元生长状态良好，MAP-2阳性细胞95﹪以上。TAT PTD-Ngb进入皮质神经元呈剂量、时间依赖性，2.0μM TAT PTD-Ngb蛋白孵育15min后在神经元内即可检测到，并在孵育2h时进入细胞内的蛋白浓度达到高峰。TAT PTD-Ngb首先进入神经元胞浆，并逐渐增多，之后逐渐出现在神经核上。进入皮质神经元内的TAT PTD-Ngb至少存在48h，72h后检测不到其存在。 结论: 养的原代皮质神经元符合实验要求。TAT PTD-Ngb能够快速、高效地穿透细胞膜进入神经元内，具有转导活性。 第三章TAT PTD-Ngb融合蛋白对缺氧诱导的皮质神经元损伤的保护及其对局灶性脑缺血的保护作用。 目的：分别在体外培养的皮质神经元缺氧损伤模型和大鼠MCAO模型上观察TAT PTD-Ngb的保护作用，并初步探讨其保护作用机制。 方法: 培养的皮质神经元分为正常无缺氧组、缺氧无处理组、TAT PTD-Ngb(2.0μM)预处理组(TAT PTD-Ngb缺氧前2h加入培养基)及Ngb(2.0μM)预处理组(Ngb缺氧前2h加入培养基)4组，对各实验组缺氧24h后再复氧24h，采用MTT法、Hoechst33258细胞核染色等方法检测皮质神经元的存活率及凋亡核形态的观察，电子显微镜观察神经元超微结构的改变。采用免疫组化的方法观察神经元Bcl-2蛋白的表达，应用紫外分光光度法检测神经元Caspase-3、Caspase-9的活性。体内实验首先证实TAT PTD-Ngb能够穿透血脑屏障进入脑组织。实验动物分为假手术组(Sham组)、TAT PTD-Ngb预处理组、TATPTD-Ngb治疗组、溶剂组，分别行MCAO手术，缺血2h再灌注72h后结束实验，观察各组在缺血再灌注24h，48h，72h的神经功能缺损评分及72h脑梗死体积。 结果: 体外实验发现，TAT PTD-Ngb预处理组与缺氧无处理组及Ngb预处理组相比，神经元存活率明显增高，神经元细胞核凋亡样变化明显减少，神经元超微结构明显改善，Bcl-2蛋白表达显著增高，神经元Caspase-3、Caspase-9活性明显下降。体内实验发现，TAT、PTD-Ngb能够穿过BBB进入脑组织。TATPTD-Ngb预处理组、TAT PTD-Ngb治疗组均能显著改善大鼠MCAO模型神经功能缺损评分，明显减小脑梗死体积。 结论: TAT PTD-Ngb对缺氧诱导的原代皮质神经元的损伤有保护作用，能穿过BBB并对大鼠局灶性脑缺血有保护作用。其保护作用可能与Ngb的线粒体保护阻断线粒体凋亡途径减少神经元凋亡有关。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化

材料与方法

第一节TAT PTD-Ngb/Ngb原核表达载体的构建

第二节TAT PTD-Ngb/Ngb融合蛋白的表达、纯化与鉴定

结果

讨论

第二章TAT PTD-Ngb融合蛋白在大鼠原代皮质神经元的转导

材料与方法

第一节大鼠皮质神经元的原代培养与鉴定

第二节TAT PTD-Ngb及Ngb融合蛋白在皮质神经元的转导

结果

讨论

第三章TAT PTD-Ngb融合蛋白对缺氧诱导的皮质神经元损伤及局灶性脑缺血的保护作用

材料与方法

第一节TAT PTD-Ngb对缺氧诱导的原代培养皮质神经元损伤的保护

第二节TAT PTD-Ngb对大鼠局灶性脑缺血的保护

结果

讨论

结论与创新

参考文献

缩略词中英文对照

攻读博士学位期间发表论文的情况

致谢

原创性声明