重组蛇毒纤溶酶rFⅡ抗脂多糖诱导的兔弥散性血管内凝血的作用及机制研究

摘要

弥散性血管内凝血(Disseminatedintravasxularcoagulation，DIC)是指以不同原因所致丧失局限性的血管内凝血系统激活为特征的获得性综合征。DIC的病理生理特征主要是机体凝血系统及纤维蛋白溶解系统相继或同时启动，导致血小板聚集、活化及释放，凝血因子消耗，弥散性血管内特别是毛细血管内纤维蛋白沉积。感染性疾病是导致DIC最常见、最重要的病因之一，其发病率在DlC常见病因中居于首位。感染性疾病并发DIC，由于纤维蛋白的沉积及广泛的微血栓形成，极易导致多器官功能衰竭，病死率高达70％以上。但是，目前临床的治疗DIC手段有限。肝素是当前DIC抗凝治疗的基本药物。然而，动物和临床资料表明，肝素虽能有效地阻断内毒素引起的DIC过程，但并不能防止多器官功能衰竭和死亡的发生。且肝素使用不当容易造成自发性出血。而抗凝血酶、水蛭素、活性蛋白C等抗凝药物用于治疗DIC还处于临床起步试验阶段，需要大规模的临床实验来证实它们的疗效。而且它们的出血倾向十分严重，临床上在DIC治疗中的应用也是很谨慎的。 虽然溶栓疗法用于DIC的治疗还处于探索阶段，但越来越多的学者认为在早期减少微血栓的形成有可能成为临床治疗DIC、开发新的治疗药物的新思路。重组蛇毒纤溶酶(recombinantfibrinogenaseFII，rFII)是本实验室用基因工程的方法自行研制的新型溶栓药。本课题组前期的研究工作证实，rFII对纤溶酶原没有激活作用，而是直接作用于纤维蛋白，水解纤维蛋白，发挥溶栓作用。药物进入体内溶栓的特异性强，由于对纤溶酶原没有激活作用，因此对凝血系统的干扰少。 研究目的： 1、研究重组蛇毒纤溶酶rFII对脂多糖诱导的兔弥散性血管内凝血的作用。 2、探讨重组蛇毒纤溶酶rFII抗脂多糖诱导的兔弥散性血管内凝血的作用机制。 3、为重组蛇毒纤溶酶rFII的开发和利用提供实验依据。 方法及结果： 1、重组蛇毒纤溶酶rFII的制备用基因工程的方法，构建了重组蛇毒纤溶酶rFII的表达质粒，在真核表达系统酵母菌中获得高效表达。经过westernblot检测，证明了重组的蛇毒纤溶酶rFII与天然的蛇毒纤溶酶高度同源，其纯度达到SDS-PAGE单一条带。通过离子交换和疏水层析，最终获得了高纯度的重组蛇毒纤溶酶rFII。纯化的重组蛇毒纤溶酶rFII通过激光飞行时间质谱分析，其质谱峰单一，其分子量大小为27.4kDa。我们对重组蛇毒纤溶酶rFII进行了HPLC分析，结果与质谱的结果相一致，表明了重组蛇毒纤溶酶rFII是一个成分单一的高纯度重组蛋白。 2、重组蛇毒纤溶酶rFII对脂多糖诱导的兔弥散性血管内凝血的作用采用JoseHermida等的方法建立兔DIC模型。脂多糖(LPS)以100μg/kg/h的速度从兔的一侧耳缘静脉滴注，同时对侧耳缘静脉给相应药物。实验分为6组：正常对照组、DIC模型组、低剂量rFII治疗组(O.025mg/kg/hrFII)、中剂量rFII治疗组(0.05mg/kg/hrFII)、高剂量rFII治疗组(0.1mg/kg/hrFII)、肝素治疗组。在给药前和给药2、6小时后分别予以动脉取血，测定血液活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、血小板计数及纤维蛋白原的变化情况；分离血浆，测定给药前和给药后2、6小时的血浆的ALT、BUN水平。实验24h后处死动物，取。肾脏与肝组织，做HE染色及纤维素染色，在光镜下观察各脏器组织的变化情况以及纤维蛋白血栓形成情况。观察实验兔24小时内生存率。 结果表明：动物给予LPS后，出现呼吸加速及呼吸困难，DIC模型组兔24小时生存率为38.5％；给予低、中、高剂量rFII治疗组动物在实验过程中生命体征比较平稳，呼吸加速及心率增快明显改善，其24小时生存率分别为58.3％、80.0％和78％。DIC模型组兔静注LPS后，大量血小板与凝血因子被活化，血小板被消耗；纤维蛋白原进行性下降；PT、APTT延长。重组蛇毒纤溶酶rFII组(尤其是高剂量rFII组)的能抑制LPS诱导的纤维蛋白原进行性下降和PT、APTT延长。DIC模型组兔血浆ALT和BUN水平6小时均迅速升高。重组蛇毒纤溶酶rFII治疗组血浆中ALT和BUN的水平明显降低。DIC模型组兔的肝脏、肾脏均可见纤维蛋白血栓形成。rFII各剂量治疗组和肝素治疗组的肝脏、肾脏组织光镜下血管内未见明显血栓形成。HE染色显示DIC模型组兔肝脏门管区明显淤血，大量炎性细胞浸润及Kupffer氏细胞增生，肝小叶结构破坏，有较多点状或片状出血灶，肝窦及中央静脉淤血。rFII各剂量治疗组和肝素治疗组肝组织的炎症细胞的浸润较对照组有不同程度减少；肝脏门管区及肝窦及中央静脉的淤血亦明显减少；肝小叶结构也较为正常。肾脏组织HE染色显示DIC模型组兔肾皮质和肾小球缺血性坏死及肾间质水肿，rFII各剂量治疗组和肝素治疗组肾脏损伤情况明显减弱。 3、重组蛇毒纤溶酶rFII体内、外溶栓作用采用肺血栓模型观察重组蛇毒纤溶酶rFII的体内溶栓作用。实验分为6组：生理盐水组，1.0、0.3、0.1和0.03mg/kg重组蛇毒纤溶酶rFII组、尿激酶组。生理盐水组兔肺血栓的湿重为24.8±1.6mg，其干重为6.0±0.3mg。尿激酶组兔肺血栓的湿重为18.0±1.3mg，其干重为4.9±0.2mg。给予1.0、0.3、0.1和0.03mg/kgrFII1小时后，兔肺血栓的湿重分别为12.6±1.5mg、14.7±1.5mg、18.3±1.1mg和20.1±1.6mg。其血栓的干重分别为3.5±0.4mg、4.0±0.3mg、4.9±0.2mg和5.2±0.2mg。与生理盐水组相比，有明显的溶栓作用。1.0、0.3mg/kgrFII溶栓作用要强于10万U/kg的尿激酶。且rFII对兔肺血栓的溶栓作用呈剂量依赖性。 用纤维蛋白平板法和血平板法测定重组蛇毒纤溶酶的体外溶栓作用。不同浓度的rFII对纤维蛋白的降解作用呈剂量和时间依赖性；在30分钟时，rFII降解纤维蛋白的作用较t-PA明显。在灭活标准纤维平板上，rFII对纤维蛋白的降解作用呈剂量和时间依赖性，而t-PA在灭活的纤维蛋白平板没有作用。rFII对兔血平板纤维蛋白的降解作用呈剂量和时间依赖性；在30分钟时，rFII降解纤维蛋白的作用较t-PA明显。在灭活兔血平板上，rFII对纤维蛋白的降解作用呈剂量和剂量依赖性，而t-PA在灭活的兔血平板没有作用。 4、重组蛇毒纤溶酶rFII体内、外降解肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的作用用ELISA法检测各组兔血浆中TNF-α的水平。将人、兔、鼠的TNF-α蛋白加入rFII(10μg/ml)在37℃温育1小时。进行SDS-PAGE电泳观察反应产物的生成情况。用Westernblot法和免疫荧光检测巨噬细胞TNF-α的表达；用ELISA法检测培养巨噬细胞上清中TNF-α的表达；RT-PCR方法检测巨噬细胞中TNF-αmRNA水平的变化。 5、重组蛇毒纤溶酶rFII底物特异性的研究将各种重组人血浆蛋白fibrinogen、albumin、γ-globulin、transferrin、antitrypsin、lgA、α2-macroglobulin、haptoglobin、laminin、complement3、complement5、complent6、complent9加入重组蛇毒纤溶酶rFII(10μg/ml)在37℃温育2小时。用SDS-PAGE观察反应产物的生成情况。测定rFII的半数致死量。 结论： 1、重组蛇毒纤溶酶rFII显著提高脂多糖诱导兔DIC的生存率。rFII抑制脂多糖诱导的弥散性血管内凝血兔血浆的ALT、BUN的升高。 2、rFII能有效溶解兔肺血栓。rFII对纤维蛋白的降解呈时间和剂量依赖性。rFII对纤维蛋白有直接降解作用，该作用不依赖于纤溶酶原。 3、重组蛇毒纤溶酶rFII能降低脂多糖诱导的兔血浆TNF－α水平。重组蛇毒纤溶酶rFII对TNF－α蛋白有直接降解作用。 4、重组蛇毒纤溶酶rFII对部分血浆蛋白如白蛋白、抗胰蛋白酶、结合珠蛋白、lgA、转铁蛋白、层粘连蛋白没有明显的降解作用。有一定的底物特异性。 5、rFII的半数致死量(LD50)为53.5mg/kg；95％可信限为48.1～59.5mg/kg。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英对照

声明

第一章绪论

一弥散性血管内凝血

1 DIC的病理生理

2. DIC治疗现状及常用药物

二蛇毒纤溶酶

1.蛇毒纤溶酶的分类

1.蛇毒纤溶酶的分子结构

3.蛇毒纤溶酶的酶学特性

4.蛇毒纤溶酶的溶栓作用

5.展望

参考文献

第二章重组蛇毒纤溶酶rFⅡ的制备

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三章 重组蛇毒纤溶酶rFⅡ对脂多糖诱导的兔弥散性血管内凝血的作用

第一节 兔弥散性血管内凝血模型的建立

3.1.1方法及材料

3.1.2实验结果

3.1.3讨论

第二节 重组蛇毒纤溶酶rFⅡ对脂多糖诱导的兔弥散性血管内凝血的作用

3.2.1材料及方法

3.2.2实验结果

3.2.3讨论

3.2.4小结

第四章重组蛇毒纤溶酶rFⅡ的体内、外溶栓作用

4.1材料与方法

4.2实验结果

4.3讨论

4.4小结

第五章 重组蛇毒纤溶酶rFⅡ体内、外降解肿瘤坏死因子的作用

5.1材料及方法

5.2实验结果

5.3讨论

5.4小结

第六章重组蛇毒纤溶酶rFⅡ的半数致死量及底物特异性的研究

6.1材料及方法

6.2实验结果

6.3讨论

6.4小结

总结

创新性

参考文献

致谢