RNA干扰抑制虎纹蛙病毒部分基因及对该病毒ORF 048的初步研究

摘要

虎纹蛙病毒(Tiger frog virus，TFV)是使养殖虎纹蛙和中华鳖发病致死的主要病原，属于虹彩病毒科，蛙病毒属。由于TFV给虎纹蛙和中华鳖的养殖带来巨大经济损失，对其致病重要基因的筛选、鉴定和研究对于有效防治尤为重要。而近年来兴起的RN干扰(RNA interference，RNAi)技术是一个研究生物体基因表达、调控与功能的有力工具。 本论文在实验室前人通过RNAi技术对TFV全基因组进行大规模初步筛查的基础上，选择了在初筛中对TFV增殖抑制效果较好的、中等的及较差的共10个开放阅读框(open reading frame，ORF)进行进一步的验证和筛选，这些基因的ORF是orf048、orf051、orf023、orf010、orf029、orf009、orf075、orf081、orf017、off032，从而成功建立了以RNA干扰技术抑制病毒增殖为基础的病毒致病重要基因的筛选体系，RNA干扰效果越好证明被抑制基因在病毒致病过程中越重要。该筛选体系是通过体外转录合成针对病毒所需要筛选ORF的siRNA，在细胞水平上将siIRNA转染至TFV敏感细胞系FHM，再进行TFV病毒感染，病毒感染细胞后特定时间段内，通过观察细胞病理变化(cytopathogenic effect，CPE)的严重程度、测定感染体系中的病毒滴度及应用实时荧光定量PCR方法定量检查mcp基因的表达量以确定病毒含量的方法，定性定量地检测RNA干扰效果并以抑制效果分为好、中等和差三个等级，从而鉴定被干扰的病毒ORF的重要性，为发掘有研究价值的病毒基因及其功能研究搭建了良好的技术平台。通过对实验数据的分析其中RNA对TFV抑制效果好的ORF有orf081、orf051、orf010、orf048、orf023、orf075；效果中等的ORF有orf009、orf029；效果差的ORF有orf017、orf032。因此可推断orf081、orf051、orf010、orf048、orf023、orf075很可能与病毒的增殖密切相关，为TFV致病相关的重要基因，与初步筛选的结果基本一致。 同时通过以上技术平台筛选，选择了对TFV增殖抑制效果比较明显的orf048基因，并且orf 048基因在实验室制作的TFV基因芯片对TFV转录组的检测中表达量最大，因此对它进行进一步研究。生物信息学分析orf 048长456 bp，编码152个氨基酸，分子量为16438.79道尔顿的蛋白，并预测该蛋白定位于细胞核。构建了真核表达载体pc048GFP，重组质粒转染FHM细胞后在荧光显微镜下观察发现病毒蛋白VP048(virus protein 048)与GFP(green fluorescent protein)的融合蛋白聚集在细胞核内，验证了生物信息学的预测结果。为了研究该基因功能，将off048基因克隆于原核表达载体pET-32a(+)，构建了pET-048重组质粒，转化BL21大肠杆菌高效地表达了带6×组氨酸标签的融合蛋白并得到蛋白免疫印迹的验证，这为该基因下一步制作抗体和筛选相互作用蛋白打下基础。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言(含文献综述)

1.1虹彩病毒简介

1.2主要蛙病毒属的研究背景

1.3蛙病毒属研究展望

1.4 RNA干扰(RNA interference，RNAi)

1.5病毒晚期基因的研究意义

1.6本文研究目的、意义

第2章在细胞水平上对TFV 10个基因进行RNA干扰

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

2.5 小结

第3章VP048的生物信息学分析及细胞定位

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

第4章VP048的原核表达

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

4.5 小结

全文小结

参考文献

缩略词

附录10个基因特异性siRNA序列

致谢

原创性声明