腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1基因表达

摘要

目的构建针对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）潜伏膜蛋白1（latent membrane protein1，LMP-1）的特异性发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA）干扰序列的重组腺相关病毒（recombinant adeno—associated virus，rAAV）载体（rAAV-shRNA—LMP-1），介导其体外表达并鉴定其生物活性。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性shRNA干扰序列，采用分子克隆的方法，将干扰序列及U6启动子插入pAAV-2质粒中，采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-shRNA-LMP-1，测定其滴度及感染效率，RT-PCR鉴定目的基因的抑制效率。结果以rAAV-EGFP5×10^4v．g（virus genome，病毒基因组数）／细胞转染C666-1细胞，转染效率大干95％，PT—PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×10^4v．g／细胞转染C666—1后目的基因抑制效率大于90％。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达，为进-步研究肿瘤基因治疗，尤其是动物实验奠定了基础。