吲哚美辛结肠靶向前药的合成以及抑制裸鼠结肠癌肝转移的研究

摘要

结肠癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，并且呈逐年增长趋势，目前手术治疗仍是其获得根治的唯一方法，但合并肝脏微转移常常是其根治性手术失败的主要原因。目前，临床上主要采用化学治疗来干预其肝转移的自然病程，基于癌细胞经门静脉通路转移至肝脏以及肝微小转移灶一直由门静脉供血至其直径达0.5 mm的理论[1,2]，结合临床实践，门静脉灌注化疗被证实为最行之有效的干预途径。而传统口服给药虽治疗方便、方法简单、患者顺应性好，终冈其无门脉化疗的药动学优势，疗效其微甚至无效。 近年来，大量资料表明吲哚美辛(IDM)对防治人肠癌及其肝转移具有一定的作用，其作用机制主要是通过环氧合酶．2(COX-2)依赖和非依赖途径发挥其抗肿瘤作用[3.4,5.6，7,8].但常规剂型口服给药途径存在着对胃肠道有强烈刺激以及外周高血药浓度引起中枢神经系统症状等诸多副作用。而口服结肠靶向释药系统(oral colon-specific drug deliver system，OCDDS)的发展为吲哚美辛常规剂型的改造应用于大肠癌及其肝转移的防治提供了契机。 OCDDS就是利用药物传递技术，保护口服药物顺利通过胃和小肠，而在结肠定位释放[9,10]。早期的研究主要集中于药物释放后对结肠局部疾病的治疗，同时减少药物的全身毒副作用[11,12]．近年来，一些研究陆续报道了通过结肠缓慢吸收的全身治疗作用，包括吸收促进剂等辅助大分子蛋白多肽如胰岛素、降钙素等的结肠吸收，发挥全身的长效疗效[12]。基于结肠内容物在结肠内滞留时间较长(达十几至几十小时)、结肠吸收进入门静脉血的生理解剖特点以及肝脏首过效应，上述基础与应用研究高度提示：一些小分子脂溶性较强的抗肿瘤药物甚至可以独自透过结肠生物膜或其细胞间隙缓慢吸收、形成门静脉较高而稳定持久的血药浓度与相应的外周低血药浓度，从而发挥出类似于门静脉灌注化疗的一定疗效。 在OCDDS设计类型中，结肠靶向前药释药系统属于自调式OCDDS(结肠独特酶系设计)中较为独特的一种，与pH依赖、时滞及压力型等其它给药系统比较，具有更强的结肠靶向特异性[13,14,15]。而采用结肠靶向前药技术改变剂型的关键是选择合适的递药载体，以达到定向释放的目的。在诸多材料中，直链淀粉(淀粉的主要组成部分)作为天然高分子化合物，不仅具有丰富、价廉、可再生、可生物降解、生物相容性好等优点，而且其安全、无毒性经长期使用已被证实，并作为药用辅料收载入各国药典[16,17,18]。就吲哚美辛结肠靶向前药的具体设计而言，根据前药设计取决于载体分子基团能否与活性母药物分子偶合，以及偶合物能否专一被结肠菌酶降解释药的理论前提，我们从化学角度分析吲哚美辛能以酯键形式(吲哚美辛的-COOH与直链淀粉的-OH反应)接枝于直链淀粉的骨架上，而酯键型前药能被哺乳类动物结肠革兰阴性厌氧菌丛所分泌的系列专属性菌酶降解。为此，本研究以直链淀粉为载体，将活性成分吲哚美辛接枝于直链淀粉上，合成并体外模拟胃肠道实验筛选出具有结肠靶向释药特性的吲哚美辛前药；体内约动学实验进一步考察其体内结肠靶向性能以及在结肠部位缓慢释放后能否通过结肠缓慢吸收而拥有门静脉及外周血的药动学优势；最后，利用它干预结肠癌裸鼠肝转移模型，评价其疗效，为结肠靶向吲哚美辛前药应用于结肠癌肝转移的防治提供进一步的体内实验依据。本实验共分为三部分，具体如下。 第一部分吲哚美辛结肠靶向前药的合成、结构表征及体外释药特性 目的：采用前药技术合成吲哚美辛一直链淀粉接枝物系列，筛选具有结肠靶向释药特性的吲哚美辛前药，并探讨直链淀粉载药量(接枝率)对接枝物体外释药特性的影响。 方法：以直链淀粉为载体材料，按照不同的接枝率，合成系列吲哚美辛一直链淀粉接枝物，用红外光谱、核磁共振等方法对其结构进行表征；将接枝物系列分别与模拟人体胃肠道环境的内容物稀释液一起孵育，在统一的多个时间点采用紫外分光光度计检测吲哚美辛的释放情况。另外，对不同载药量的接枝物系列进行溶胀性测试。 结论： IDM-Am-3具有一定的体内结肠靶向性能，具有较为明显的门静脉及外周血药动学优势，能维持门静脉较稳定而持久的血药浓度与外周低血药浓度，为IDM-Am-3应用于结肠癌及其肝转移的防治提供了药动学方面的理论与实验依据。 第三部分吲哚美辛结肠靶向前药抑制裸鼠结肠癌肝转移的研究 目的：探讨结肠靶向前药IDM-Am-3对结肠癌肝转移的抑制作用。 方法：采用人结肠癌细胞株HT-29行脾内种植后切除脾脏建立结肠癌裸鼠肝转移模型；36只裸小鼠随机分为3组，每组12只，空白对照组予0.2％DMSO-生理盐水0.2ml／d灌胃，原药组及前药组灌药剂量均为IDM 3mg／kg·d(前药组按IDM的净含量计)的等体积溶液；连续用药2周后处死，观察肿瘤肝转移状况，免疫组化检测肝转移瘤组织内MVD及VEGF表达： 结果：(1)空白对照组、原药组及前药组肿瘤肝转移发生率分别为100％、83％和58％，前药组转移率显著低于空白对照组(P<0.05)；前药组肝转移瘤数目明显少于原药组和空白对照组，差异有统计学意义(与原药组比较P<0.05：与空白对照组比较P<0.01)，原药组也显著少于空白对照组(P<0.05)；空白对照组、原药组和前药组肝脏较大转移瘤(≥2mm)数目依次为6.08±2.02、3.58±1.93及2.75±2.63个，前药组与原药组明显少于空白对照组，差异有统计学意义(前药组P=0.009，原药组P：0.014)。(2)前药组和原药组VEGF表达均比空白对照组明显降低(前药组与空白对照组比较P<0.01，原药组与空白对照组比较P<0.05)：空白对照组、原药组及前药组MVD计数均值分别为38.83±10.79、28.92±13.55及26.50±11.16，前药组和原药组VEGF表达均比空白对照组明显降低，差异有统计学意义(P值均<0.05)。 结论：与空白对照组比较，结肠靶向前药IDM-Am-3有着较为强大的裸鼠结肠癌肝转移抑制作用；而与原药IDM对比，IDM-Am-3有着较为有效的裸鼠结肠癌肝转移抑制作用；某种程度上间接肯定了IDM-Am-3在防治结肠癌肝转移方面能起到门脉灌注化疗的一定效果，可作为门脉化疗的有益补充，值得进一步深入研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前言

第一部分吲哚美辛结肠靶向前药的合成、结构表征及体外释药特性

导言

一、材料与仪器

二、实验步骤

三、结果

四、讨论

五、小结

第二部分吲哚美辛结肠靶向前药大鼠门静脉及外周血的药动学研究

导言

一、材料与仪器

二、实验步骤

三、结果

四、讨论

五、小结

第三部分吲哚美辛结肠靶向前药抑制裸鼠结肠癌肝转移的研究

导言

一、材料与仪器

二、方法

三、结果

四、讨论

五、小结

六、附彩图

总结与展望

参考文献

文献综述一 非甾体抗炎药防治结直肠肿瘤的分子机制及研究进展

文献综述二 口服结肠靶向前药释药系统

致谢