重组假丝酵母脂肪酶高密度发酵工艺放大及酶热稳定性研究

摘要

褶皱假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase)基因工程菌的高密度发酵研究经历了从5L到800L规模的逐级放大过程，研究显示在小规模(30L以下)发酵条件下，维持pH条件稳定的指数流加控制方式即已能满足高密度生产需求。随着规模扩大，诸多在小规模发酵时可忽略的因素，如环境稳定、产物蛋白降解等，成为了新限制条件，对这些条件进行的单因子和正交优化研究表明，需要采用分段流加控制策略才能够保证大规模发酵成功。该策略将发酵过程划分为两个独立阶段，分别保持pH、温度、搅拌等环境条件的稳定，在48 hr时采用近稳态方式进行平稳过渡。实验证明，该策略有利于维持菌体生长和产物代谢平衡。800L，发酵实验获得了稳定的14000 IU ml-1脂肪酶酶活和约500 g l-1细胞湿菌重。该发酵工艺高效、廉价，具有大规模工业应用的潜力。 耐热脂肪酶研究结果显示氨基酸残基组成、寡肽片段组成和二元模式组成与蛋白耐热性存在显著关联。Ala，His，Leu，Gly，Pro，Phe，Met，Trp，Tyr，KC，EE，KE，RE，VE，YI，EK，VK，EV，YV，EY, KY,VY, YY组成与耐热性正相关；Asn，Arg，Cys，Ile，Gin，Glu，Lys，Thr，Ser，QC，QH，QN，HQ，MQ，NQ，QQ，TQ，QS，QT组成与耐热性负相关。三种组成从不同层次，不同角度提取耐热蛋白序列信息，相互关联补充，较为全面的体现了序列性质特征。采用SVM算法的嗜热蛋白分类研究结果显示，同时采用三肽片段特征与二元模式特征的平均分类准确率达到98％，采用三肽片段特征的平均分类准确率达到96％，采用二元模式特征的平均分类准确率达到95％，采用二肽片段特征的平均分类准确率达到85％，而采用氨基酸残基组成特征的平均分类准确率达到74％。 在参考DNA重排(DNA Shuffling)实验方法的基础上，发展了蛋白质序列重排(Sequence Shuffling)技术，构建了耐热脂肪酶电子重组体库。该文库包含有15620条由5条嗜热和常温脂肪酶序列经重排算法衍生获得的重组体。经过脂肪酶三元催化特征筛选和耐热性分类筛选，共获得了87条推测耐热脂肪酶序列。 结构分析结果显示部分推测序列与天然耐热脂肪酶序列高度相似，具有成为新耐热脂肪酶的可能。利用该结果可以减少实验工作量，提高成功率。在蛋白质性质改造应用中具有广阔前景。

目录

文摘

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论文说明：常用缩略词

声明

第1章绪论

1.1引言

1.2脂肪酶

1.3毕赤酵母

1.4高密度发酵

1.5蛋白质热稳定性

1.6本文立题依据与主要工作

1.7参考文献

第2章小规模发酵条件摸索与优化

2.1引言

2.2实验材料与方法

2.2.1仪器材料

2.2.2实验方法

2.3基因工程菌的构建与筛选

2.3.1毕赤酵母高效分泌表达体系的构建与鉴定

2.3.2工程菌遗传稳定性与发酵稳定性的检测

2.4发酵培养基的优化

2.4.1碳源、氮源的选择与优化

2.4.2金属元素与微量元素的选择优化

2.5摇瓶发酵条件的优化

2.5.1培养温度与pH条件优化

2.5.2接种量与培养周期优化

2.6 5L发酵罐条件优化

2.6.1分批发酵

2.6.2补料培养

2.7讨论

2.7.1工程菌的遗传稳定性与发酵稳定性

2.7.2氮源与微量元素对产酶的影响

2.7.3培养温度与培养pH对产酶的影响

2.7.4接种量的影响

2.7.5溶氧的影响

2.7.6发酵周期对产酶的影响

2.7.7流加方式对高密度发酵及产酶的影响

2.8小结

2.9参考文献

第3章大规模发酵工艺研究

3.1引言

3.2实验材料与方法

3.2.1仪器材料

3.2.2实验方法

3.3发酵动力学研究

3.3.1葡萄糖代谢途径

3.3.2葡萄糖代谢化学计量方程

3.3.3细胞比生长速率对脂肪酶表达的影响

3.4 30L罐发酵工艺研究与优化

3.4.1指数流加发酵条件的实现

3.4.2目的蛋白降解研究

3.4.3分段控制方式研究

3.5 800L罐发酵工艺的实现

3.5.1分段控制流加工艺的实现

3.5.2蛋白降解控制的实现

3.5.3下游处理的影响与实现

3.6讨论

3.6.1细胞密度与比生长速率

3.6.2细胞得率与产物得率

3.6.3分段调控与发酵环境稳定性

3.6.4目的蛋白的降解调控

3.6.5发酵放大过程的影响因素及其研究

3.7小结

3.8参考文献

第4章蛋白耐热性与序列特征的关系

4.1引言

4.2数据与方法

4.2.1数据源与数据

4.2.2数据库平台的建立

4.2.3数据库结构的设计

4.3蛋白序列数据库基本特征分析

4.3.1古细菌蛋白序列数据集基本特征

4.3.2原核生物蛋白序列数据集基本特征

4.3.3真核生物蛋白序列数据集基本特征

4.4耐热性与蛋白质序列关系的研究

4.4.1氨基酸残基个数与耐热性的关系

4.4.2氨基酸残基组成与耐热性的关系

4.4.3寡肽片段组成与耐热性的关系

4.4.4二元模式组成与耐热性的关系

4.5讨论

4.5.1蛋白质残基组成对耐热性的影响

4.5.2寡肽片段组成对耐热性的影响

4.5.3二元模式组成与蛋白质残基相互作用的关系及其对耐热性的影响

4.6小结

4.7参考文献

第5章基于全局观点提高脂肪酶耐热性的研究

5.1引言

5.2数据与方法

5.2.1数据源与数据

5.2.2支持向量机概述

5.2.3特征向量的提取

5.2.4分类系统的优化、训练和预测

5.2.5序列重排(Sequence Shuffling)与电子突变体库的构建

5.3基于脂肪酶一级序列的耐热性判别分类

5.3.1基于序列氨基酸组成的单因子分类研究

5.3.2基于序列寡肽片段组成的单因子分类研究

5.3.3基于序列二元模式组成的单因子分类研究

5.3.4基于序列特征组成的多因子分类研究

5.4常温脂肪酶耐热性进化电子重组体库的构建

5.4.1重组体库的构建与筛选

5.4.2重组体序列与结构分析

5.5讨论

5.5.1判别分类的准确率、灵敏度与特异性

5.5.2电子重组体库的构建与全局观点的影响

5.6小结

5.7参考文献

总结与展望

在学期间发表的论文

致谢