粗糙脉孢菌两类snoRNA的结构与功能及进化研究

摘要

本研究利用实验RNA组学和计算机RNA组学相结合的方法对粗糙脉孢菌两类snoRNA进行了全面的基因组分析和实验鉴定，首次从粗糙脉孢菌中鉴定55种box C／D snoRNA和20种box H/ACA snoRNA。功能预测分析指出52种向导box C／D snoRNA可指导74个位点的甲基化修饰，包括67个rRNA位点，4个$nRNA位点和3个tRNA位点。粗糙脉孢菌的box C／D snoRNA及其指导的甲基化修饰位点的数目都多于两种单细胞酵母即酿酒酵母和粟酒裂殖酵母。功能分析表明14种向导box}UACA snoRNA可指导17个rRNA位点的假尿嘧啶化修饰，另外的6个分子属于孤儿snoR．NA。粗糙脉孢菌box H／ACA snoRNA分子较大，而且大多数分子的二级结构不是典型的“发夹-铰链-发夹-尾”的二级结构，这说明多细胞真菌box H／ACA snoRNA的结构具有特殊的性质。另外，高比例的孤儿snoRNA暗示粗糙脉孢菌snoRNA的功能多样性。 SnoRNA及其指导的修饰位点的同源性分析显示：粗糙脉孢菌两类snoRNA在另一种多细胞真菌-稻瘟菌中高度保守。在稻瘟菌基因组中鉴定出44种与粗糙脉孢菌box C／D snoRNA同源分子， 18种与粗糙脉孢菌box H／ACA snoRNA同源分子。与酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的比较分析发现，粗糙脉孢菌有32个不同于酵母的修饰位点；而粗糙脉孢菌预测的17个假尿嘧啶化修饰位点中的6个在酵母中找不到同源修饰位点。这些结果表明，多细胞真菌snoRNA的结构和功能要比单细胞酵母复杂和丰富。 SnoRNA的基因组织及表达模式分析表明，粗糙脉孢菌box C／D snoRNA和box H／ACA snoRNA采用不同的编码策略，box C／D snoRNA主要以内含子编码方式为主，而box H/ACA snoRNA以独立转录的编码方式为主。粗糙脉孢菌中存在6个box C／D snoRNA基因簇，其中的5个基因簇在酿酒酵母和裂殖酵母以及稻瘟菌中高度保守，暗示这五个基因簇具有古老的起源，在真菌分化之前已经存在。有趣的是，本研究还发现，粗糙脉孢菌中也存在“UHG”型的基因组织形式，如基因簇Ⅰ和Ⅱ，而且，在基因簇Ⅰ和Ⅱ的表达分析实验中，发现了可变剪接现象的存在，这种现象曾在哺乳动物的snoRNA的宿主基因gas5中发现。这说明，非蛋白质编码基因存在可变剪接的现象起源较早，可能是一个基因表达的普遍机制。 本研究开展了snoRNA的进化分析，发现在真菌分化以前，snoRNA是采用内含子编码snoRNA的基因组织形式；为了保证修饰位点的保守性，snoRNA与rRNA之间存在着协同进化现象：比较了单细胞酵母与粗糙脉孢菌及稻瘟菌的同源snoRNA的结构和功能发现，分离和重组是真菌snoRNA基因进化的方式之一：本研究得到的77种粗糙脉孢菌snoRNA中除了U3 snoRNA以及CD46之外，其它snoRNA基因都是单拷贝基因，仔细分析粗糙脉孢菌的基因组信息发现，重复诱导点突变机制(RJP)可能是粗糙脉孢菌snoRNA缺少变体的原因之一。 本研究以粗糙脉孢菌为研究对象，全面分析了粗糙脉孢菌中box C／D和H／ACA两类snoRNA基因，首次获得了大量的多细胞真菌的snoRNA数据，深入地研究了真菌snoRNA结构与功能、基因组织与表达模式以及基因起源和进化，研究结果对阐明真核生物snoRNA结构与功能进化具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1 snoRNA的研究概况

1.1.1 snoRNA的研究历史

1.1.2 snoRNA的研究现状

1.2 snoRNA的结构与功能

1.2.1 snoRNA的结构与分类

1.2.2 snoRNA的功能

1.2.3 snoRNA与人类疾病相关

1.3 snoRNA的基因组织形式与表达

1.3.1 snoRNA在动物中的基因组织形式

1.3.2 snoRNA在植物中的基因组织形式

1.3.3 snoRNA在真菌中的基因组织形式

1.3.4 snoRNA在低等真核生物中的基因组织形式

1.4 snoRNA的应用

1.4.1 snoRNA作为特异位点甲基化修饰的工具

1.4.2 snoRNA作为核仁内定位的工具

1.5本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1计算机程序鉴定粗糙脉孢菌中snoRNA候选分子

2.1.1生物信息学数据来源

2.1.2生物信息学数据处理工具软件

2.1.3 snoscan程序鉴定粗糙脉孢菌中boxC/D snoRNA候选分子

2.1.4 snoGPS程序鉴定粗糙脉孢菌中box H/ACA snoRNA候选分子

2.2粗糙脉孢菌小RNA cDNA文库的构建

2.2.1菌株和培养基

2.2.2粗糙脉孢菌的总RNA的提取

2.2.3甲醛变性琼脂凝胶电泳检测总RNA

2.2.4粗糙脉孢菌小RNA的PEG富集

2.2.5引物的同位素标记和纯化

2.2.6 RNA 3'末端加poly(A)尾

2.2.7 cDNA第一链的合成

2.2.8从变性聚丙烯酰胺凝胶中回收cDNA

2.2.9回收cDNA的3'末端加G尾

2.2.10 PCR扩增及PCR产物纯化

2.2.11纯化后的PCR产物与载体连接

2.2.12转化

2.2.13保种

2.3 cDNA文库的筛选及DNA序列测定

2.3.1菌落PCR

2.3.2重组质粒的提取

2.3.3测序反应及测序反应产物纯化

2.3.4点杂交筛选cDNA文库

2.4粗糙脉孢菌中snoRNA候选分子的鉴定

2.4.1粗糙脉孢菌的总RNA的提取

2.4.2寡核苷酸探针的同位素标记和纯化

2.4.3粗糙脉孢菌中部分snoRNA候选分子的Northern杂交鉴定

2.4.4粗糙脉孢菌中部分snoRNA候选分子的逆转录分析

2.5粗糙脉孢菌中snoRNA的功能分析

2.5.1粗糙脉孢菌中box C/D and box H/ACA snoRNAs的功能预测

2.5.2粗糙脉孢菌中部分box C/D snoRNAs的功能鉴定

2.6粗糙脉孢菌中box C/D snoRNA基因簇的表达分析

2.6.1粗糙脉孢菌中box C/D snoRNA基因簇的RT-PCR分析

2.6.2粗糙脉孢菌中boxC/D snoRNA基因簇的剪接成熟体的克隆

2.6.3粗糙脉孢菌中boxC/D snoRNA基因簇的剪接成熟体的DNA序列分析

2.7所用计算机软件及数据库

2.7.1所用的基因组数据库

2.7.2所用的计算机程序及软件

第三章结果与分析

3.1粗糙脉孢菌box C/D snoRNA的发现和鉴定

3.1.1计算机预测粗糙脉孢菌box C/D snoRNA候选分子

3.1.2粗糙脉孢菌box C/D snoRNA特异的cDNA文库构建和筛选

3.1.2粗糙脉孢菌boxC/D snoRNA的鉴定

3.1.3粗糙脉孢菌boxC/D snoRNA的序列及结构特点

3.2粗糙脉孢菌box C/D snoRNA的功能分析及鉴定

3.2.1粗糙脉孢菌box C/D snoRNA的功能分析

3.2.2 BoxC/D snoRNA指导的部分新甲基化位点的鉴定

3.3粗糙脉孢菌U3 snoRNA的鉴定及其表达和功能分析

3.3.1粗糙脉孢菌U3 snoRNA的鉴定

3.3.2粗糙脉孢菌中U3 snoRNA的结构及功能分析

3.3.3粗糙脉孢菌U3 snoRNA基因分析

3.4粗糙脉孢菌box H/ACA snoRNA的发现和鉴定

3.4.1计算机预测粗糙脉孢菌box H/ACA snoRNA候选分子

3.4.2粗糙脉孢菌box H/ACA snoRNA特异的cDNA文库构建和筛选

3.4.3粗糙脉孢菌box H/ACA snoRNA的鉴定

3.4.4粗糙脉孢菌box H/ACA snoRNA的序列及结构特点

3.5粗糙脉孢菌box H/ACA snoRNA的功能分析

3.6粗糙脉孢菌boxC/D和H/ACA snoRNA的基因组织

3.6.1粗糙脉孢菌boxC/D snoRNA的基因组织以内含子编码为主

3.6.2粗糙脉孢菌box H/ACA snoRNA以独立转录的基因组织形式为主

3.6.3粗糙脉孢菌box C/D snoRNA基因簇

3.7粗糙脉孢菌box C/D snoRNA基因簇的表达分析

3.7.1粗糙脉孢菌boxC/D snoRNA基因簇Ⅰ的表达分析

3.7.2粗糙脉孢菌box C/D snoRNA基因簇n的表达分析

3.7.3粗糙脉孢菌box C/D snoRNA基因簇Ⅲ的表达分析

3.7.4粗糙脉孢菌box C/D snoRNA基因簇Ⅳ的表达分析

3.7.5粗糙脉孢菌box C/D snoRNA基因簇Ⅴ的表达分析

3.7.6粗糙脉孢菌box C/D snoRNA基因簇Ⅵ的表达分析

3.8本研究鉴定的粗糙脉孢菌snoRNA基因列表

3.8.1粗糙脉孢菌中鉴定得到的box C/D snoRNA列表

3.8.2粗糙脉孢菌中鉴定得到的box H/ACA snoRNA列表

3.9同源snoRNA结构和功能比较及进化分析

3.9.1粗糙脉孢菌与酵母同源snoRNA的结构和功能比较

3.9.2粗糙脉孢菌与稻瘟菌同源snoRNA的结构和功能比较

3.9.3粗糙脉孢菌snoRNA与rRNA的协同进化

3.9.4五个box C/D snoRNA基因簇的比较分析

第四章讨论

4.1首次全面鉴定祖糙脉孢菌box C/D和H/ACA snoRNAs

4.2粗糙脉孢菌snoRNA的功能多样性

4.3粗糙脉孢菌两类snoRNA在稻瘟菌中高度保守

4.4粗糙脉孢菌snoRNA基因组织及表达模式的多样性

4.5分离和重组是真菌snoRNA基因进化的方式之一

4.6 RIP机制可能是粗糙脉孢菌缺少snoRNA变体的主要原因

结束语

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢