粗糙脉孢菌糖转运蛋白功能及产酶条件优化研究

摘要

本论文对粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）进行了两方面的研究工作。一部分是三个纤维二糖转运蛋白基因的研究，另一部分是对产酶培养基优化的研究。
　　微生物将生物质降解为各种糖类物质，这些糖类物质通过糖转运蛋白运送到细胞中，并在细胞中进行进一步的代谢。在自然界中，糖转运蛋白对于碳水化合物的代谢起着至关重要的作用。在非葡萄糖转运蛋白的研究中，纤维二糖转运蛋白的研究非常少见。粗糙脉胞菌具有纤维素降解，乙醇发酵，木糖应用等杰出特点，是一个非常有工业应用潜力的丝状真菌。2010年，有科学家首次从粗糙脉孢菌中克隆鉴定了纤维二糖转运蛋白基因CDT1、CDT2。但是对其生理生化功能、基因表达调控等分子机理还不很了解。
　　本论文以三个纤维二糖转运蛋白为研究对象，分别为CDT1、CDT2和CDT3。实验中构建并获得了三个基因的单敲除体菌株，双敲除体菌株及三敲除体菌株。并且在不同碳源培养基中生长这些菌株，通过纤维素内切酶酶活，木聚糖酶酶活等指标反映各个菌株之间的生长差异。结果表明，在以纤维二糖为碳源的培养基中生长的三敲除体菌株T123生长较双突变菌株D12差，说明CDT3基因与纤维二糖转运相关。并通过绿色荧光蛋白GFP对糖转运蛋白进行了定位。定位结果显示，糖转运蛋白均在各种膜上进行表达。
　　本论文第二部分是以粗糙脉孢茵基因组测序菌株FGSC2489为对象，采用响应面分析法对粗糙脉孢菌摇瓶发酵产纤维素酶的培养基进行优化。在初始培养基的基础上，采用该优化培养基，最大纤维素酶活可达:1.27FPU/mL,是优化前纤维素酶活的2.02倍;CMC酶活14.15IU/mL是优化前的1.88倍，木聚糖酶活24.13IU/mL是优化前的1.86倍，葡萄糖苷酶酶活1.22IU/mL是优化前的2.08倍。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 粗糙脉孢菌

1．2 糖转运蛋白

1．2．1 糖转运蛋白简介

1．2．2 动物糖转运蛋白

1．2．3 植物糖转运蛋白

1．2．4 微生物糖转运蛋白

1．2．5 纤维二糖

1．2．6 糖转运蛋白研究进展

1．3 生物质能源

1．3．1 生物质简介

1．3．2 生物质能资源利用的现状与意义

1．4 纤维素降解与纤维二糖转运蛋白

1．5 生物质降解与纤维素酶

1．5．1 纤维素酶的来源

1．5．2 纤维素酶的种类及作用机制

1．5．3 纤维素酶的生产

1．5．4 纤维素酶的应用与前景

1．5．5 响应面法优化粗糙脉孢菌产纤维素酶培养基

1．6 本论文的研究目的及意义

1．7 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 主要药品

2．1．3 仪器与设备

2．1．4 主要培养基

2．1．5 主要溶液

2．2 实验方法

2．2．1 菌种的培养

2．2．2 多突变体的筛选

2．2．3 考马斯亮蓝法(BradFord法)测定蛋白含量

2．2．4 CMC-Na酶活与滤纸酶活(FPU)的测定

2．2．5 木聚糖酶酶活测定

2．2．6 生物量的测定

2．2．7 单突变体菌株Native启动子互补体的构建

2．2．8 产酶培养基的优化—响应面法

3 结果与讨论

3．1 粗糙脉孢菌纤维二糖转运蛋白功能研究

3．1．1 粗糙脉孢菌纤维二糖转运蛋白多突变体的构建与筛选

3．1．2 粗糙脉孢菌各突变体在Avicel培养基中的表型

3．1．3 粗糙脉孢菌各突变体木聚糖培养基的表型

3．1．4 粗糙脉孢菌各突变体在纤维二糖培养基中的表型

3．1．5 粗糙脉孢菌各突变体在单糖及蔗糖培养基中的表型

3．1．6 粗糙脉孢菌各突变体在秸秆培养基中的表型

3．1．7 糖转运蛋白基因互补体的构建

3．2 粗糙脉孢菌产酶培养基的优化

3．2．1 粗糙脉孢菌基本产酶水平分析

3．2．2 Plackett-Burman实验结果与分析

3．2．3 爬坡实验结果与分析

3．2．4 中心组合设计及响应面分析

3．2．5 模型验证试验

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢