粗糙脉孢菌全基因组范围内糖转运蛋白基因家族功能研究

摘要

随着人们对生物基燃料和化学品需求的增加，木质纤维素降解酶的表达分泌机理及其生物质水解物快速发酵成为研究的热点。糖转运蛋白能够将胞外小分子单糖转运进入胞内，对利用木质纤维素降解产物至关重要，同时，糖转运蛋白恩能够起到信号传递的功能，影响丝状真菌纤维素酶的调控。而木质纤维素降解真菌粗糙脉孢菌天然具有吸收利用多种单糖和寡糖的能力，是研究纤维素降解的模式真菌，但是目前基因组中注释的预测糖转运蛋白中仍然有过半功能未知，因此本研究以粗糙脉孢菌为研究对象，进一步鉴定了丝状真菌糖转运蛋白底物并探究了糖转运蛋白在纤维素酶表达分泌中的作用。
　　为了鉴定粗糙脉孢菌中其他未知的糖转运蛋白，本研究从全基因组水平系统分析了粗糙脉孢菌预测糖转运蛋白的转运底物，发现了两个假定的糖转运蛋白(NCU01868和NCU08152)具有转运多种己糖底物的功能，因此分别命名为NcHXT-1和NcHXT-2。利用荧光共振能量转移技术(FRET)进一步证实了NcHXT-1/-2具有葡萄糖转运功能。在己糖转运蛋白全缺酿酒酵母EBY.VW4000中分别过表达NcHXT-1/-2，能恢复其在葡萄糖、半乳糖或甘露糖的液体培养基中生长并生成乙醇的能力，说明两者在改造工程菌株促进其利用生物质水解物合成生物基化学品方面具有潜在的应用价值。
　　转运蛋白作为细胞与外界环境物质交换的媒介，同时起到了识别底物并传递分子信号的作用，对丝状真菌纤维素酶的诱导表达具有重要影响。探究粗糙脉孢菌糖转运蛋白突变体在纤维素条件下纤维素酶的分泌和表达，证实NcHXT-2在粗糙脉孢菌木质纤维素酶诱导表达中起到负调控作用。同时通过构建NcHXT-2与两种高亲和力葡萄糖转运蛋白HGT1/2的多突变体，发现NcHXT-1与Hgt-1/2对纤维素酶分泌的作用存在冗余现象。尽管在粗糙脉孢菌生长前期，NcHXT-2的缺失导致了AMP环化酶基因表达的上调，但NcHXT-2对纤维素酶负调控仍需要进一步的实验证实。
　　经过进化树分析发现NcHXT-1/-2在很多常见纤维素降解真菌中均具有的同源蛋白，为纤维素降解丝状真菌遗传改造提高其生物质降解酶的活性提供了潜在了靶点。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 糖转运蛋白的研究进展

1．1．1 糖转运蛋白的分类和功能

1．1．2 酿酒酵母糖转运蛋白

1．1．3 糖转运蛋白在底物信号感应及传导中的作用

1．1．4 糖转运蛋白在工业微生物中的利用

1．1．5 研究糖转运蛋白的方法

1．2 丝状真菌糖转运蛋白在纤维素降解方面的应用

1．2．1 粗糙脉孢菌简介

1．2．2 粗糙脉孢菌在研究纤维素降解方面的进展

1．2．3 以粗糙脉孢菌为代表的丝状真菌的糖转运蛋白

1．2．4 糖转运蛋白在纤维素酶表达分泌中的作用

1．3 课题研究的目的意义与技术路线

1．3．1 研究的目的与意义

1．3．2 课题研究的技术路线

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验用的菌株、质粒及引物

2．2 常用培养基及储存液的配置

2．2．1 常用储存液的配制

2．2．2 常用培养基的配制

2．3 实验方法

2．3．1 RNA提取与纯化

2．3．2 RNA反转录合成cDNA

2．3．3 DNA片段克隆、重组与转化

2．3．4 大肠杆菌质粒提取(质粒小提试剂盒)

2．3．5 酵母热击转化

2．3．6 酵母平板生长实验

2．3．7 酵母绿色荧光蛋白(GFP)亚细胞定位及荧光共振能量转移(FRET)荧光拍照

2．3．8 荧光共振能量转移(FRET)测试

2．3．9 重组酿酒酵母发酵

2．3．10 遗传进化树的构建

2．3．11 粗糙脉孢菌有性杂交试验

2．3．12 蛋白浓度测定

2．3．13 纤维素酶活测定

2．3．14 实时定量PCR

第3章 结果与分析

3．1 粗糙脉孢菌糖转运蛋白的功能分析

3．1．1 粗糙脉孢菌糖转运蛋白表达载体的构建

3．1．2 用于荧光共振能量转移检测的质粒的构建

3．1．3 用于荧光共振能量转移的质粒的荧光检测

3．1．4 酿酒酵母EBY．VW4000重组菌株的表型分析

3．1．5 利用荧光共振能量转移技术评价NcHXT-1／-2的葡萄糖转运功能

3．1．6 过表达NcHXT-1／-2酵母的发酵测试

3．1．7 NcHXT-1／-2的遗传进化树分析

3．2 粗糙脉孢菌糖转运蛋白在纤维素酶表达分泌过程中的功能解析

3．2．1 粗糙脉孢菌NcHXT-1／-2单基因突变体的验证及表型分析

3．2．2 粗糙脉孢菌糖转运蛋白与高亲和力葡萄糖转运蛋白多突变体的构建及表型分析

3．2．3 单／多基因突变体对纤维素酶调控的影响

第4章 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

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