细胞复制性衰老及过氧化氢诱导早衰过程中表观遗传学调控

摘要

1研究背景: 细胞不断经受内源性和外源性的各种应激和损伤，体外培养的人成纤维细胞具有一定的增殖能力，经过一系列传代之后，逐渐变得衰老，即细胞复制性衰老。氧化应激可以导致DNA损伤或干扰异染色质，因而诱导早期传代的细胞过早衰老，即应激诱导的细胞早衰。过氧化氢可短期内作用于细胞获得氧化应激诱导的早衰。细胞复制性衰老与应激诱导的早衰具有相似的衰老表型，如细胞变大扁平，伴随有核和核仁的体积增大，失去细胞与细胞间接触，衰老相关β-半乳糖苷酶表达等等，而两者具体的内在调控机制可能存在差异。细胞衰老的机制可能是人类衰老及衰老相关性疾病的分子基础。 延缓衰老及治疗衰老相关性疾病是人类最大的梦想之一，目前对于衰老机制的认识仍很局限。近来研究表明，表观遗传学，也称外遗传学，是研究机体发育及细胞增殖过程中基因表达调控的改变，这些改变可受环境因素的影响，其修饰的改变可能是细胞衰老一个决定性因素。表观遗传学修饰包括DNA甲基化和组蛋白的转录后修饰，即组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰，ATP依赖的染色质结构重塑。然而，在表观遗传学和细胞及器官衰老方面的研究资料尚较匮乏，这可能跟衰老本身的复杂性有关。目前有限的资料表明，DNA甲基化可能修饰一些衰老相关调控基因，随着年龄增加，这种修饰作用减弱或增强，确定这些改变是随机的或“程序性”的，及是否受环境氧化应激的影响十分重要。组蛋白H3和H4N末端共价修饰可促进染色质重建，组蛋白修饰及其不同组合参与基因转录的活化或沉默。 衰老是内、外因素共同作用的结果，是一种多基因的复合调控过程，但衰老的始动因素及其发生、发展机制仍有待探究。表观遗传学修饰可能提供了细胞衰老所需的表观微环境，如果能通过此途径揭示衰老的分子机制，且找到延缓衰老进程的方法，将具有重大的生物学意义和临床应用前景。 本研究应用体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞为研究对象，检测正常细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的细胞早衰过程中表观遗传学调控的作用，包括全基因组DNA甲基化、整体的组蛋白乙酰化及甲基化变化；表观遗传学相关酶的表达变化及其活性改变；衰老相关基因mRNA水平表达变化及其转录调控区域DNA甲基化改变和组蛋白修饰状况；并寻找正常年轻细胞及复制性衰老细胞基因组转录调控区域未知的差异甲基化基因，为细胞衰老过程中表观遗传学调控作用提供理论依据。 2材料与方法: 2.1建立细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的细胞早衰模型建立体外培养的正常人胚肺成纤维细胞复制性衰老模型及400μM过氧化氢诱导的细胞早衰模型，观察在细胞正常复制性衰老及早衰过程中，细胞的一般生物学特性改变，包括细胞形态，生长曲线，寿命周期，细胞周期分布及衰老相关β-半乳糖苷酶表达的变化。 2.2检测基因组DNA甲基化调控以5-甲基胞嘧啶抗体免疫荧光方法及[3H]甲基掺入法检测人胚肺成纤维细胞基因组DNA整体甲基化变化趋势；基于ELISA样反应方法检测甲基转移酶总的活性改变；并以Q-PCR和WesternBlot方法检测甲基转移酶和甲基化结合蛋白mRNA和蛋白水平的表达变化，同时观察了5-氮杂胞苷对各甲基转移酶和甲基化结合蛋白表达的影响。 2.3组蛋白整体乙酰化与甲基化调控以相应抗体的细胞免疫荧光方法观察组蛋白H3，H4整体乙酰化趋势及组蛋白H4(Lys20)整体甲基化趋势的改变；基于ELISA样反应方法检测组蛋白总体去乙酰化酶的活性变化；并以Q-PCR方法检测乙酰化酶的mRNA表达，以Q-PCR方法和WesternBlot方法检测去乙酰化酶的mRNA和蛋白水平的表达，同时观察曲古霉素A对乙酰化酶和去乙酰化酶表达的影响。 2.4检测衰老相关基因的表达及其启动子区甲基化状况以Q-PCR方法检测P53，PI6，IGF2，P66，FOXA2的mRNA表达水平；在亚硫酸氢盐修饰基因组DNA的基础上，以甲基化特异性PCR检测上述基因启动子区域的甲基化状况；同时对年轻细胞，复制性衰老细胞及早衰细胞组的P66，FOXA2启动子区域的CpG岛进行克隆测序，全面观察其CpG岛甲基化修饰状况。 2.5衰老相关基因转录调控区域的组蛋白乙酰化及甲基化修饰以染色质免疫沉淀结合定量PCR的方法检测年轻细胞，中年细胞，复制性衰老细胞及早衰细胞组P53，P16，IGF2，P66，FOXA2基因转录调控区域的组蛋白修饰情况，包括组蛋白H3，H4乙酰化修饰及组蛋白H3(Lys4)，H4(Lys20)的甲基化修饰状况。 2.6检测年轻细胞及复制性衰老细胞转录调控区域CpG岛差异表达基因以甲基化的DNA免疫沉淀结合基因芯片技术检测年轻细胞及复制性衰老细胞启动子及第一外显子区域CpG岛差异表达的基因，并进行两组细胞差异的甲基化基因感兴趣分类。 3结果: 3.1细胞复制性衰老与细胞早衰具有相同的形态学特征和增殖能力体外培养的正常人胚肺成纤维细胞于52PDL进入不可逆的复制性衰老状态，依据细胞的群体倍增水平(PDL)，分为22PDL(年轻细胞组)，35PDL(中年细胞组)和49PDL(复制性衰老细胞组)。同步培养的22PDL人胚肺成纤维细胞，以400μMH2O2连续染毒4次，每天1次，每次2h，染毒后继续培养7天，细胞呈现不可逆的早衰状态，分为早衰起始组和早衰持续组。复制性衰老及早衰细胞处于衰老状态后均可维持存活1个月以上，细胞变大扁平，饱和度降低。复制性衰老模型中各组细胞群体倍增时间为22PDL48h，35PDL52h，49PDL96h。细胞早衰模型中，4次染毒期间，细胞均有不同程度的增殖，染毒4次后，细胞几乎停止增殖，处于明显的不可逆早衰状态。复制性衰老的细胞寿命周期为110天，早衰的为50天。细胞周期分布中G1％分别为22PDL35.5％，35PDL72.6％和49PDL89.5％及早衰起始组61.6％，早衰持续组77.2％：细胞增殖指数随增龄呈现降低的变化趋势。衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率分别为22PDL5.1％，35PDL15.7％和49PDL90.7％及衰老起始组43.8％，衰老持续组91.3％。 3.2衰老的细胞呈现较低的基因组DNA甲基化水平，复制性衰老与早衰甲基化调控存在差异甲基化免疫荧光实验结果显示，细胞复制性衰老过程中，基因组DNA甲基化水平逐渐降低；染毒组细胞早衰过程中，基因组DNA甲基化水平也逐渐降低；【3H]甲基掺入实验得到一致的结果，甲基化的CpG％分别为22PDL68.2％，35PDL41.9％和49PDL16.1％及早衰起始组63.5％，早衰持续组18.0％。复制性衰老及早衰的细胞都呈现出明显的低甲基化水平。 3.3衰老的细胞呈现整体组蛋白H3，H4低乙酰化及H4K20高甲基化水平，复制性衰老与早衰组蛋白修饰调控存在差异细胞免疫荧光结果显示，细胞衰老过程中，与年轻细胞相比，组蛋白H3，H4整体乙酰化趋势逐渐降低，早衰起始组略低于中年细胞组，早衰持续组同复制性衰老细胞组；组蛋白H4(Lys20)整体甲基化趋势，复制性衰老细胞组升高，早衰持续组同复制性衰老细胞组。 3.4细胞衰老相关基因表达发生改变，与其启动子区甲基化调控有不同程度关联在细胞衰老过程中，与年轻细胞组mRNA表达水平相比，复制性衰老细胞组P53表达升高，中年细胞组显著升高，而早衰持续组无明显变化；中年细胞组P16表达降低，而复制性衰老细胞组明显升高，早衰持续组也升高：中年细胞组及复制性衰老细胞组IGF2表达升高，早衰持续组显著升高；中年细胞组及复制性衰老细胞组P66表达升高，早衰持续组升高显著：复制性衰老细胞组及早衰持续组FOXA2表达均明显降低。 4结论: 4.1获得人胚肺成纤维细胞体外复制性衰老模型及成功建立稳定的过氧化氢诱导细胞早衰模型，细胞复制性衰老与细胞早衰具有相同的形态学特征和增殖能力。 4.2基因组DNA低甲基化，整体组蛋白H3，H4低乙酰化和H4K20高甲基化状态是细胞衰老发生的表观微环境，表观遗传学相关酶的表达与活性改变参与其形成与维持。 4.3在细胞衰老过程中，特异基因表达发生变化，其转录调控区域特定的DNA甲基化和组蛋白修饰参与基因的转录调控。 4.4细胞复制性衰老与细胞早衰的表观遗传学调控机制存在差异，氧化应激可能通过表观遗传学修饰的变化作用于细胞早衰的发生。 4.5获得人胚肺成纤维细胞年轻阶段及复制性衰老阶段转录调控区域高甲基化的特异基因谱。 基于上述结果，表观遗传学修饰是细胞衰老发生的重要调控机制，其作用的表观微环境及对特异靶基因的特定修饰，是重要的表观遗传学改变，参与细胞衰老的发生，发展和持续，而细胞复制性衰老与细胞早衰其内在的表观遗传学机制存在差异。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引 言

第一章细胞复制性衰老及过氧化氢诱导细胞早衰模型建立

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第二章细胞复制性衰老及早衰过程中基因组DNA甲基化调控模式

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第三章细胞复制性衰老及早衰过程中组蛋白整体乙酰化及甲基化调控

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第四章衰老相关基因表达及启动子区甲基化调控

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第五章衰老相关基因启动子区组蛋白乙酰化及甲基化修饰

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第六章衰老相关基因差异甲基化谱

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

综合讨论

全文结论

参考文献

测序结果附图1

测序结果附图2

附录

衰老相关研究进展

致 谢