mPGES-1抑制剂MK886对白血病细胞增殖及耐药性的影响

摘要

目的:急性白血病(acuteleukemia，AL)是常见的血液系统恶性肿瘤之一。目前化疗在AL的治疗中仍有不可替代的地位，但部分AL患者通过化疗始终不能完全缓解(completeremission，CR)或CR后复发。为了提高白血病的治愈率，延长白血病患者的无病生存期，需要积极寻找新的治疗靶点或化疗增敏剂。 膜结合型前列腺素E2合酶1(membrane—boundprostaglandinE2synthase1，mPGES-1)，是靶向合成前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)的特异性终末酶，对肿瘤的发生、发展具有重要作用。研究发现mPGES-1在正常组织中表达很低或不表达，但在多种实体肿瘤如非小细胞肺癌、结肠癌、胃癌和乳腺癌中的表达水平明显升高，抑制mPEGS-1的表达可显著抑制肿瘤的生长。mPEGS-1可能作为肿瘤治疗的一个新的靶基因，已引起肿瘤研究者的关注。 mPEGS-1对肿瘤细胞抑制作用的机制未明，有研究认为可能与调控PGE2的生物合成有关。PGE2属于前列腺素类化合物(prostanoid，PGs)，可通过与G蛋白耦联受体EP1、EP2、EP3和EP4结合，调控包括磷酸肌醇—3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide3kinese/serine—threoninekinase，PI3K/AKT)通路在内的多条信号通路促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和刺激血管生成等作用促进肿瘤的发生、发展，而抑制PGE2的合成可达到抗肿瘤效果。PGE2的生物合成受磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)、环氧化酶(cyclooxygenase，COX)和mPEGS-1三种酶的顺序调控，抑制上述三种酶的表达均可抑制PGE2的合成。 已有研究表明，白血病细胞COX—2表达水平增高，特异性COX—2抑制剂可抑制白血病细胞增殖，诱导细胞凋亡，增强白血病细胞对化疗药物的敏感性。但COX—2抑制剂可以引起肾脏损害，增加心血管疾病发病和导致血栓形成的危险，而且抑制COX—2活性在削减PGE2生成量的同时也使得具有抗癌作用的PGI2.PGD2的合成受抑，从而消弱其抗肿瘤效应，因此其临床应用前景受到很大的限制。从理论上来讲，直接抑制靶向PGE2合成的酶系mPEGS-1在减少副作用方面可能更具优势。迄今为止，关于mPGES-1与白血病的关系国内外均未见有文献报道。 本研究在证实白血病HL—60、HL—60/A细胞株高表达mPGES-1的基础上，采用细胞培养、流式细胞术及westernblot、实时多聚酶链反应(real—timepolymerasechainreaction，real—timePCR)等多种细胞生物学技术，检测mPGES-1抑制剂MK886作用后细胞mPGES-1、COX—2mRNA和蛋白的表达情况，观察MK886对HL—60、HL—60/A细胞增殖、凋亡及细胞耐药的影响，并检测AKT信号通路的相关蛋白的变化，探讨其发生机制，为mPGES-1抑制剂作用于白血病提供有价值的实验依据，为白血病的治疗拓展新的思路和方法。 本研究采用的统计学方法：计量资料的描述用均数±标准差(-x±s)表示，多组资料间的比较采用单因素方差分析。应用SPSS10.0统计软件作统计学处理。检验水准定为P≤0.05有统计学意义。 本研究共分三部分进行论述。 第一部分mPGES-1、COX—2在白血病HL—60和HL—60/A细胞的表达及意义 目的：观察HL—60和HL—60/A细胞mPGES-1、COX—2及多药耐药基因mdr-1的表达，探讨mPGES-1、COX—2在白血病中的作用及与耐药的关系。 方法：采用real—timePCR法对人急性髓系白血病敏感细胞株HL—60及耐阿霉素(adriamycin，ADM)的耐药细胞株HL—60/A的mPGES-1、COX—2及多药耐药基因mdr-1mRNA进行检测，用westernblot法检测HL—60、HL—60/A细胞mPGES-1、COX—2蛋白，流式细胞术检测mdr-1基因编码多药耐药蛋白P170的表达，与正常单个核细胞(mononuclearcell，MNC)进行比较。 结论： (1)正常MNC低表达mPGES-1、COX—2，白血病HL—60、HL—60/A细胞高表达mPGES-1、COX—2，mPGES-1可成为白血病治疗的新的作用靶点。 (2)耐药细胞株HL—60/A中mPGES-1的表达高于敏感细胞株HL—60，mPGES-1可能成为逆转白血病耐药的一个潜在的分子靶点。 第二部分mPGES-1抑制剂MK886对HL—60和HL—60/A细胞增殖、凋亡的影响 目的：观察mPGES-1抑制剂MK886作用后HL—60、HL—60/A细胞mPGES-1、COX—2表达和PGE2合成的变化以及MK886对HL—60、HL—60/A细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响，并进一步检测PI3K/AKT通路中AKT、磷酸化AKT(phosphorylatedAKT，P—AKT)、Bcl—2、Bax表达、caspase—3活性及c—myc表达的变化，探讨抑制mPGES-1表达对白血病细胞增殖的影响及其作用机制。 方法：(1)提取经不同浓度MK886作用48h后HL—60和HL—60/A细胞的RNA和蛋白，分别用real—timePCR法及westernblot方法检测mPGES-1、COX—2mRNA和蛋白的表达情况。(2)收集经不同浓度MK886作用48h后HL—60和HL—60/A的细胞培养上清，ELISA法检测上清液中PGE2的含量。(3)倒置显微镜下观察经不同浓度的MK886作用不同时间后HL—60和HL—60/A细胞形态的变化，并采用CCK—8(CellCountingKit—8)法检测细胞存活率。(4)流式细胞术检测经不同浓度MK886作用48h后HL—60和HL—60/A细胞凋亡率及细胞周期分布，荧光显微镜下观察经Hoechst33258染色的凋亡细胞。(5)提取经不同浓度MK886作用48h后HL—60和HL—60/A细胞的蛋白，westernblot方法检测AKT、P—AKT、Bax、Bcl—2、c—myc蛋白表达的变化。(6)比色法检测MK886作用后HL—60和HL—60/A细胞的caspase—3活性。 结论： (1)mPGES-1抑制剂MK886可剂量依赖性的下调HL—60、HL—60/A细胞mPGES-1 mRNA和蛋白的表达，抑制PGE2的合成，对COX—2的表达无影响。 (2)MK886可抑制HL—60、HL—60/A细胞增殖，诱导细胞凋亡，其作用机制与抑制PGE2的合成，进而调控AKT通路及其下游的Bcl—2家族和caspase—3活性有关。 (3)MK886可阻滞细胞周期于G0/G1期，细胞周期的停滞与MK886抑制PGE2合成，抑制AKT活性及下调c—myc表达有关。 第三部分MK886对HL—60/A细胞耐药性的影响 目的：观察MK886能否增强HL—60/A细胞的化疗敏感性，检测不同浓度的MK886对HL—60/A细胞mdr-1mRNA以及P170蛋白表达的影响，并结合前两部分实验结果，探讨MK886改变细胞化疗敏感性的可能作用机制。 方法：(1)CCK—8法检测HL—60、HL—60/A细胞对阿霉素(adriamycin，ADM)、柔红霉素(dauhorubicin，DNR)、阿糖胞苷(cytrarabine，Ara—C)、依托泊苷(etoposide，VP-16)等四种化疗药物的敏感性及10 μmol/L MK886(此浓度的MK886对HL—60/A细胞无明显毒性作用)作用48h后HL—60/A细胞对化疗药物敏感性的变化，观察MK886对HL—60/A细胞的耐药性有无影响。(2)采用real—time PCR和流式细胞术检测经不同浓度MK886作用48h后HL—60/A细胞mdr1基因及P170蛋白的表达。 结论： (1)白血病HL—60、HL—60/A细胞高表达mPGES-1及COX—2，mPGES-1抑制剂MK886可剂量依赖性下调mPGES-1mRNA和蛋白的表达，抑制PGE2的合成，对COX—2的表达则无影响。 (2)MK886可抑制HL—60、HL—60/A细胞增殖，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期于G0/G1期，作用机制与MK886抑制PGE2的合成，调控AKT通路及其下游的Bcl—2家族，下调c—myc表达和caspase—3活性有关。mPGES-1可能成为白血病治疗的新靶点。 (3)耐药细胞株HL—60/A中mPGES-1的表达高于敏感细胞株HL—60，MK886可通过抑制PGE2的合成，下调P170表达和诱导凋亡等作用增强HL—60/A对化疗药物的敏感性。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一部分mPGES-1、COX-2在白血病HL-60和HL-60/A细胞的表达和意义

第1章前言

第2章材料与方法

第3章结果

第4章讨论

第5章结论

第二部分mPGES-1抑制剂MK886对HL-60和HL-60/A细胞增殖、凋亡的影响

第1章前言

第2章材料与方法

第3章结果

第4章讨论

第5章结论

第三部分MK886对HL-60/A细胞化疗敏感性的影响

第1章前言

第2章材料与方法

第3章结果

第4章讨论

第5章结论

全文总结

今后的研究方向

参考文献

附图

致谢