雷帕霉素联合供体未成熟树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受

摘要

器官移植已成为挽救终末期器官功能衰竭病人生命的有效途径。外科技术和免疫抑制治疗的进步已经很大地改善了器官移植病人的短期存活率。然而，目前的免疫抑制剂有多种副作用，而如何改善移植病人的长期生存率和生活质量已成为当前器官移植领域的重要课题。解决这些问题的最终途径就是诱导免疫耐受。 树突状细胞(dendriticcells，DC)作为机体惟一能激活初始型T细胞(naiveTcells)的专职抗原提呈细胞(antigen—presentingcells，APC)，在诱导免疫应答和免疫耐受中都起重要作用。目前，对DC免疫学功能的研究已取得了较大进展：①未成熟DC(immatureDC，iDC)和成熟DC(matureDC，mDC)都能够拥有致耐受特性。②DC的致耐受特性都与调节性T细胞(regulatoryTcells，Treg)有关。DC诱导免疫耐受的机制包括诱导T细胞无能、删除反应性T细胞，或促进Treg增殖。最近的研究更支持Treg的作用。Treg被认为在致耐受DC细胞下游信号转导中起关键作用。③DC俘获和交叉提呈外源性抗原的独特功能在无炎症环境下能诱导抗原特异性免疫耐受。 雷帕霉素(Rapamycin，RAPA，又名sirolimus)作为一种大环内酯类的新型免疫抑制剂，已被广泛应用于临床抗排斥治疗。研究表明，RAPA不仅能影响T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能，也能直接抑制DC发育成熟和诱导DC凋亡，RAPA还能增加体内Treg来诱导免疫耐受。 本文通过体外培养大鼠髓源性DC，分析了雷帕霉素对未成熟DC和已成熟DC表型和细胞存活影响的差异，观察雷帕霉素处理后不同成熟状态DC分泌细胞因子水平及介导同种混合淋巴细胞增殖反应的变化。建立大鼠同种异体原位肝移植模型，通过供体髓源性未成熟DC回输受体大鼠联合术后短期应用雷帕霉素，观察受体大鼠的生存时间，以及外周血和脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增殖情况，探讨雷帕霉素联合未成熟DC诱导移植免疫耐受的可能机制。 第一部分雷帕霉素对大鼠髓源性树突状细胞表型和功能的影响 DC在成熟过程中表型特征和功能均发生很大变化。未成熟DC显示出较强的致耐受特性，但成熟DC在某些环境下也具有免疫调节能力。有研究表明，雷帕霉素能直接抑制DC抗原提呈功能、细胞迁移和发育成熟并诱导DC凋亡。为了进一步明确RAPA对DC功能的影响及其机制，我们研究了RAPA处理不同成熟状态大鼠髓源性DC的细胞表型变化、凋亡情况、细胞因子分泌以及刺激同种异基因T淋巴细胞增殖能力的变化，并从分子生物学角度初步探讨了RAPA对维持DC自身生存和发挥免疫学功能的细胞信号转导通路的影响。 我们使用重组大鼠粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(rrGM—CSF，终浓度为20ng/ml)和重组大鼠白细胞介素—4(rrIL—4，终浓度为10ng/ml)成功地体外培养出大鼠髓源性DC，大鼠DC特异性细胞表面标志物OX62阳性细胞数大于85％。在培养第6d加入脂多糖(LPS)的同时加入RAPA(1～100ng/ml)，2d后流式细胞仪(FACS)检测结果显示OX6(MHCⅡ类分子)和共刺激分子CD40和CD86的上调显著受抑，细胞凋亡增加。 因成熟DC在特殊环境下也可拥有致耐受特性，我们研究了RAPA对LPS刺激48h后成熟DC的影响。发现RAPA对已完全成熟的DC表型影响较小，已成熟的DC能抵抗临床相关剂量RAPA(1～20ng/ml)的促凋亡作用。凝胶迁移率实验(EMSA)结果显示，LPS刺激后的成熟DC细胞核内NF—κB被强烈激活，RAPA不改变已成熟DC中NF—κB的DNA结合能力。因此，成熟DC对RAPA诱导凋亡的抵抗作用可能与NF—κB的活化有关。 我们进一步研究了RAPA对DC分泌细胞因子的影响。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示iDC在LPS作用下，IL-10和IL-12的分泌显著增加。但同时加入RAPA后，IL-10和IL-12的分泌水平均降低。而且和其低的细胞因子水平相一致，混合淋巴细胞反应(MLR)中，这种RAPA处理后的iDC激活同种异基因T细胞的能力降低。第8d的mDC加入RAPA培养24h以后，IL-10和TNF—α分泌减少，但IL-12却不再受抑制。Real—timePCR结果显示，IL-12p35mRNA水平没有变化，但IL-12p40mRNA的表达稍有上升。RAPA处理后的mDC具有不同的细胞因子表达水平说明了这种成熟DC细胞内信号转导通路发生了改变。这种IL-12/IL-10的平衡向IL-12倾斜可能促进Th1反应并激发免疫应答，但我们的研究发现这种RAPA处理后的成熟DC同样具有低的刺激同种异基因T细胞增殖的能力。MLR中T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子IFN—γ和Th2型细胞因子IL—4均降低。RAPA处理的DC抑制效应性T细胞增殖的同时，允许Treg细胞的活化和增殖可能解释其抑制性的同种异基因T细胞增殖作用。通过调节DC功能来诱导或维持免疫耐受作用在某些环境下要求受者体内DC的成熟和存活，同种异基因T细胞对RAPA处理后的成熟DC的低反应性可能为移植免疫耐受的诱导提供新的思路。 第二部分大鼠同种异体原位肝移植模型的建立与改进 大鼠肝移植模型是进行移植免疫学研究的理想动物模型。我们在“二袖套法”的基础对大鼠肝移植模型进行了改良。以近交系雄性Lewis(LEW)大鼠和雄性BrownNorway(BN)大鼠为供受体，实验动物随机分为3组：①对照组(n=12)：正常LEW大鼠为实验对照；②同基因组(n=12)：LEW→LEW大鼠；③急性排斥组(n=12)：LEW→BN大鼠。肝上下腔静脉后壁的吻合采用供体腔静脉壁与受体膈肌环吻合，前壁采用腔静脉壁对腔静脉壁吻合。各组术后14d和28d分别处死3只，观察术后大鼠肝功能、移植肝组织病理学变化。每组留6只观察生存时间。结果显示，手术成功率大于85％。急性排斥组术后出现ALT和BIL急剧上升，Banff评分Ⅲ级，大鼠中位存活时间为32d。而同基因组ALT和BIL经术后短期上升后14d时即出现下降，Banff评分0～1级，大鼠能长期存活。说明改良“二袖套法”LEW→BN大鼠肝移植模型是稳定的急性排斥反应模型，可用于研究肝移植排斥反应和免疫耐受。 第三部分雷帕霉素联合未成熟树突状细胞促进CD4+CD25+Foxp3+T细胞增殖并诱导大鼠肝移植免疫耐受 CD4+CD25+Treg在对自身抗原和移植物的免疫耐受中发挥重要作用。体外实验表明雷帕霉素能促进小鼠和人Treg增殖。RAPA处理的负载供者抗原的受体源性DC联合短期应用RAPA能使小鼠心脏移植物长期存活。但RAPA联合iDC是否能提高体内Treg水平尚未阐明。我们研究了供者源性iDC联合移植术后短期使用RAPA后受体大鼠外周血和脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平以及是否能诱导大鼠肝移植免疫耐受。 首先，我们研究了RAPA联合iDC诱导同种异基因大鼠产生Treg的情况。FACS结果显示，正常大鼠外周血和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞的比例在6％～8％之间，与文献报道一致。单用RAPA腹腔注射7天或一次性静脉注射2×106数量的iDC并不增加CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+T细胞中的比例。而联合使用RAPA和iDC后，CD4+CD25+Foxp3+Treg在外周血和脾脏CD4+T细胞中的比例增加(分别为9.31±0.54％和9.38±0.89％)。CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+CD25+T细胞的比例也增加。 由于联合使用供者源性未成熟DC和移植后短期应用RAPA对受体T细胞增殖的影响以及这种方案是否能诱导免疫耐受均未被阐明，我们建立了Lewis→BN大鼠肝移植模型。大鼠分四组：①急性排斥组(n＝12)：术后连续7天腹腔注射生理盐水1ml；②RAPA组(n=12)：术后连续7天腹腔注射RAPA1mg/kg/day(day0～day6)；③未成熟DC组(iDC，n＝12)：术前3天(day—3)单次尾静脉注射LEW大鼠髓源性培养第6天的未成熟DC(2×106)；④RAPA+iDC组(n=12)：术前3天单次尾静脉注射LEW大鼠髓源性培养第6天的未成熟DC(2×106)，术后连续7天腹腔注射RAPA1mg/kg/day。术后14、28d随机处死3只，测定肝功能、血清IL—2和IL-12，以及外周血和脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。每组各留6例观察生存期。 结论：雷帕霉素对未成熟DC和已成熟DC刺激同种异基因T淋巴细胞增殖的能力都具有抑制作用。输注供体髓源性未成熟DC联合术后短期使用雷帕霉素的方法能明显促进肝移植术后外周血和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg的增殖，减轻大鼠肝移植术后免疫损伤并诱导免疫耐受。这种新的治疗策略可能成为诱导移植后免疫耐受有价值的临床应用方案。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 雷帕霉素对大鼠髓源性树突状细胞表型和功能的影响

1.1前言

1.2材料和方法

1.3结果

1.4讨论

1.5小结

参考文献

第二部分 大鼠同种异体原位肝移植模型的建立与改进

2.1前言

2.2材料

2.3方法

2.4结果

2.5讨论

2.6小结

参考文献

第三部分 雷帕霉素联合未成熟树突状细胞促进CD4+CD25+Foxp3+T细胞增殖并诱导肝移植免疫耐受

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

参考文献

全文总结

附录一 综述：致耐受树突状细胞与移植免疫耐受

附录二 缩略词

附录三 博士期间发表和完成的论文

致 谢