谢氏丙酸杆菌维生素B代谢途径基因组改组

摘要

维生素B12作为动物和人体的一种必需维生素，广泛地用于治疗恶性贫血，配制维生素复合制剂，动物饲料和食品的添加剂等方面。其应用前景广阔，需求量巨大，虽然近年来全球产量有较大的提高，但仍供不应求。国内只有少数的厂家生产且多为引进国外生产技术，但与国外先进水相比平仍有较大差距。因此展开维生素B12高产菌株的选育和生物技术的研究，提高国内生产技术就显得非常重要。 通过分离纯化，获得一株维生素B12产量为1.85mg/L的谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)作为出发菌株，命名为P.shermanii-17。采用亚硝基胍-紫外线与甲磺酸乙酯-紫外线两种不同复诱变方法对出发菌株进行诱变，在丙酸为pH6.0，含乙硫氨酸和四氯化碳的抗性培养基上筛选获得了2株维生素B12产量为2.31 mg/L和2.42 mg/L的正突变株，分别比母株提高25％和31％，命名为P.shermanii—NU—31和P.shermanii—EU—49。 利用灭活双亲原生质体融合方法，对谢氏丙酸杆菌进行原生质体融合，确定灭活双亲原生质体融合的条件为：种子液培养48 h，悬浮于0.5 mol/L蔗糖·丁二酸钠(1∶1)高渗缓冲液，10 mg/ml溶菌酶酶解2h；在紫外线和60℃水浴中分别灭活45 min和2h，将两灭活亲本稀释至106个/ml后等量混合，PEG6000融合液融合6 min，抗性再生培养基中培养，恒温培养箱30℃培养4周。 应用双亲灭活原生质体融合法对谢氏丙酸杆菌进行两轮基因组改组，在丙酸为pH5.5的抗性培养基上筛选获得一株维生素B12产量为2.85 mg/L，比母株提高54％的菌株，命名为P.shermanii—F2-3。将改组菌株和母株进行发酵过程比较，菌体浓度、丙酸耐受性和维生素B12产量均不同程度提高，表明基因组改组技术能有效提高多基因调控表型的进化。 为了揭示基因组改组菌的代谢调控机制，研究了基因组改组菌与出发菌之间的蛋白质组学图谱的差异。提取发酵第四天改组株P.shermanii—F2-3和母株P.shermanil-17的胞内蛋白进行双向电泳，通过Image Master软件分析两菌株凝胶，搜索Swiss2D—PAGE数据库相应的等电点(pI)、分子量(Mw)，找出基因组改组菌株38个表达量改变蛋白，其中上调蛋白22个，16个下调蛋白，28个蛋白已在数据库进行鉴定。并且确定改组株6个维生素B12主要相关代谢途径上调蛋白：谷氨酰tRNA合成酶(Glutaminyl—tRNA synthetase，glnS)、δ—氨基乙酰丙酸脱水酶(Delta—aminolevulinic acid dehydratase，hemB)、甲硫氨酸合成酶(Methionine synthase，metH)、核黄素合成酶(Riboflavin synthase，ribE)、磷酸果糖激酶(Phosphofructo kinase，pfkA)和异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase，icd)。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1维生素B12的研究概况

1.2发酵菌种的选育技术

1.3基因组改组技术在微生物遗传育种中的应用

1.4蛋白质组学研究

1.5立项背景和选题意义

第二章谢氏丙酸杆菌维生素B12高产菌株筛选

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果与讨论

第三章谢氏丙酸杆菌基因组改组研究

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果与讨论

第四章双向电泳对菌株基因组改组初步研究

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3实验结果与讨论

第五章结论

参考文献

附录 缩略词

致谢