中药材佛手的种质资源及遗传多样性研究

摘要

佛手(Buddha's Hand citron)，学名Citrus medica L.var．sarcodactylis(Noot.)Swingle，为芸香科柑橘属植物香橼(Citrus medica L.)的变种，十大广药之一，是传统的名贵中药。佛手不仅可供药用，还可发展佛手盆景市场，其挥发油可应用于食品和化妆品等方面，因而具有很大的开发利用价值。但由于长期以来粗放种植，致使品种混杂、退化，病虫害严重，产量和品质参差不齐，严重妨碍了佛手产业的规范化种植和质量控制。本文从植株形态、SSR分子标记两方面对采自浙江金华，重庆南龙，广东肇庆、高要、武垄、潮州、梅州、汕头(来自新加坡)等共八个地方的佛手进行分析，以研究其各种质间的亲缘关系，为佛手GAP规范化种植提供有益的技术支持。 从叶片气孔器特征和花粉两方面研究三种佛手的形态差别，观察和测量了40枚叶片的气孔器和50粒花粉的形状和大小，发现来自浙江、重庆、广东三个佛手品种，在气孔器和花粉形态特征上比较一致，差异较小。 利用Fastprep法成功提取了3省8个佛手居群的基因组DNA，结果发现从当年生已完全展开的叶片提取的DNA质量和得率都较好，完全满足实验需要。利用汕头(来自新加坡)和浙江金佛手群体中的植株DNA，从53对SSR引物中筛选出5对可以扩增出条带清晰、多样性高、反应稳定的引物。其中，CCSM3的扩增产物多态性最高，可以扩增出4条在各居群内具有多样性的条带。其次为P1223可以扩增出3条在各居群内具有多样性的条带。CCSM19和CCSM12这两对引物只能分辨出汕头的佛手个体，多样性最低。在扩增过程中建立了优化的20μl体积的SSR反应体系和PCR反应程序。 利用筛选出的5对SSR引物对8个居群的122个个体进行研究，共发现13个等位基因。采自汕头(种源来自新加坡)的多样性最高，其香农指数Ⅰ、观测杂合度Ho、期望杂合度He分别为0.648、0.733、0.547。其次为广佛手潮州的居群。广佛手高要和川佛手重庆群体的多样性最低，其香农指数Ⅰ、观测杂合度Ho、期望杂合度He都为0，所用引物未能在这两个居群中得到具有多态性的条带。广佛手其余各群体多样性相近。推测佛手群体尤其是我国佛手遗传多样性很低的原因可能是在约700年的栽培历史中，长期营养繁殖、人工选择以及缺乏野生种质交流，导致佛手种质的遗传多样性流失严重，遗传基础变得很窄，基因趋于纯合。 F—统计显示佛手出现了较高的群体间遗传分化(Fst—0.277)，群体间基因流小于1(Nm＝0.726)也证实了这一结论。采用Mantel统计学检验，比较遗传距离和地理距离的相关性，结果显示佛手群体间的遗传距离和地理距离相关性很高(F＝0.903)，但显著度很低(P=0.993)，结果不可靠。这与本实验的采样主要集中于广东境内，未采到分布于东南亚等地的佛手居群有关。而且国内近年来，佛手干片和鲜果价格持续走低，很多种植户将佛手砍掉，改种其它经济作物，造成采样困难。 本文的研究结果显示：我国佛手种质资源的遗传多样性较低，远远低于新加坡的佛手种质的遗传多样性。研究的佛手群体可明显的分为3大类：采自广东汕头(来自新加坡)的自成一支，与其它种群的遗传距离较大；广佛手5个群体与重庆采的川佛手亲缘关系很近，一共6个居群构成一支；金佛手自成一支，介于新加坡分支和由广佛手、川佛手共同构成的分支之间。推测川佛手很可能是由广佛手传播到当地，在长期的栽培历史中在人工选育下形成的。而广佛手则可能与金佛手来自同一种源，都是来自东南亚国家。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1佛手研究概述

1.1.1种质资源研究概述

1.1.2古代文献记载

1.1.3植物特征

1.1.4形态特征——鲜果、佛手干片

1.1.5显微特征——花粉、叶片

1.1.6化学成分——醇提取物和挥发油

1.1.7营养成分——灰分、粗脂肪、全氮和挥发油的含量

1.1.8红外光谱、紫外光谱分析

1.1.9佛手生物技术研究进展

1.2分子标记方法在中药材遗传多样性上的应用

1.2.1 RFLP标记

1.2.2 RAPD标记

1.2.3 AFLP标记

1.2.4 ISSR标记

1.2.5 SSR标记

1.3本项研究的选题目的、意义及依据

第二章佛手不同品种的形态结构

2.1样品的采集

2.2实验方法

2.2.1三种主要佛手品种的叶片结构

2.2.2两种主要佛手品种的花粉结构

2.3结果与分析

2.3.1光学显微镜下金佛手、川佛手和广佛手的叶表皮特征

2.3.2金佛手和广佛手花粉的形态特征和表面纹饰

2.4讨论

第三章佛手不同居群的遗传多样性研究

3.1实验试剂、仪器及样品采集

3.1.1试剂

3.1.2仪器

3.1.3样品采集

3.2总DNA的提取和检测

3.2.1总DNA的提取(FastPrep法)

3.2.2总DNA质量的测定

3.3 SSR引物来源及合成

3.4 PCR扩增

3.5 PCR反应体系的优化

3.6聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.7银染

3.8数据处理与分析

3.8.1群体遗传多样性及遗传结构分析

3.8.2聚类分析

3.8.3相关性分析

第四章佛手不同居群的种质遗传多样性研究结果

4.1总DNA提取

4.2适合指纹图谱构建的SSR标记技术的建立

4.2.1 PCR反应体系的优化

4.2.2 SSR引物的筛选

4.3佛手遗传多样性和遗传结构的分析

4.3.1遗传多样性分析

4.3.2遗传结构分析

4.4聚类分析

4.4.1群体聚类

4.4.2个体聚类

第5章佛手不同居群的种质遗传多样性的问题与讨论

5.1银染

5.2引物的选择

5.3佛手的遗传多样性

5.4佛手的育种

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

附表

附图

致谢