戊型肝炎病毒感染的血清学特征及分子生物学诊断

摘要

戊型肝炎(H epatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)引起的一种急性病毒性肝炎，主要经粪一口途径传播，常因饮用水源被污染而导致暴发流行，散发病例呈现全球分布。在我国的很多地区都有HEV感染的报道，HE流行率在我国为17.2％左右，各省市分布不均，农村HEV感染率高于城市。根据HEV各分离株基因序列的核苷酸同源性、氨基酸同源性的大小以及系统进化树的分析，目前将世界上HEV主要分为4个基因型。临床上急性HEV感染率占总人口的0.5％～1％，感染率随年龄增加而增加，20岁左右达到感染高峰，发病者主要为青壮年，其临床表现主要是肝炎病毒引起的黄疸、急性肝坏死等。一般呈良性经过，但孕妇感染情况较重，死亡率高达15％N25％，是一种全国普遍流行、危害比较严重的疾病。
　　 HEV是无包膜单股正链RNA病毒。HEV基因组全长约7.2～7.6kb，由5’和3’非结构区及3个相互重叠的编码阅读框(Open Reading Frames.ORF)ORF1，ORF2和ORF3组成，基因组结构较为复杂。其中ORF2编码病毒衣壳蛋白，富含HEV重要抗原表位。HEV组织培养研究尚不成熟，目前的诊断主要是采用间接酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测血清中的抗体。但因为HEV感染窗口期或患者自身免疫功能以及检测方法的特异性等原因都会给HEV诊断带来不确定性；HEV RNA检测是目前判断HEV是否存在的标准之一，但由于HEV存在多种基因型，给临床研究工作和疫苗的研制带来了很多困难。鉴于此，本课题建立了一种快速、敏感、特异性强的巢式逆转录聚合酶链式反应(Nest ReverseTranscription- Polymerase Chain Reaction，nRT-PCR)方法，用于血清HEV RNA的定性检测，并探讨其在辅助临床进行戊型肝炎早期诊断中的价值。
　　 研究目的:
　　 1、了解近年戊型肝炎病毒感染患者的临床特征及血清学特点；分析比较单纯感染和重叠感染的戊型肝炎患者的血清学特征异同，阐明重叠感染的戊型肝炎患者病情的发展及预后情况。为HEV的临床诊治和进一步研究提供参考。
　　 2、建立巢式逆转录PCR扩增血清HEV RNA方法，评价其应用于急性戊型肝炎患者血清HEV RNA检测的临床意义。
　　 研究方法:
　　 1、收集667例戊型肝炎病毒(HEV)感染以及戊型肝炎病毒重叠感染患者的相关血清学指标并与乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染患者进行回顾性资料分析。诊断标准依据2000年(西安)中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的“病毒型肝炎防治方案”中的病毒型肝炎诊断标准。凡抗-HEV IgM和/或抗-HEV IgG阳性，并具有急性病毒性肝炎的临床表现和肝功能异常者，诊断为急性戊型肝炎。
　　 2、对GenBank数据库中的戊型肝炎病毒全基因组序列进行分析比对，并针对国内流行的戊型肝炎病毒株序列，选择位于ORF2的保守区域设计引物，建立nRT- PCR方法，并检测126例急性戊型肝炎患者、20例甲型肝炎患者、30例乙型肝炎患者和30例丙型肝炎患者血清中戊型肝炎病毒RNA，以30例健康献血者作为对照组。全部样品提取RNA后进行nRT- PCR检测HEV RNA，并与检测抗-HEV IgM的方法进行比较。
　　 研究结果:
　　 1、HEV感染病例多分布在21～40岁年龄段；且女性多于男性。在HEV阳性患者中，青少年组与青年组、中年组，老年组在ALP项差异具有统计学意义。老年组HEV感染患者的各项指标都处于较高水平；HEV重叠感染患者的年龄高峰都是在21～40岁之间，低年龄组与高年龄组的多重感染率均较低。HEV感染组与HEV-HBV重叠感染组比较，ALP、TBIL存在明显差别，胆汁淤积增多，黄疸程度加深。HEV感染组与HEV-HCV重叠感染组LDH差异显著，肝细胞损伤明显。
　　 2、126例急性戊型肝炎患者血清中有67例(53.2％) HEV RNA阳性。对照组血清HEVRNA检测均为阴性。与血清抗-HEV IgM检测结果比较，HEV RNA检测的总符合率为80.91％(102/126)，两种方法的检测结果具有良好的一致性。nRT- PCR方法检测HEV RNA与血清抗-HEV IgM检测方法存在明显的差异，不能相互替代，而有一定的互补性。3例患者的首份血清检测为HEV RNA阳性，但抗-HEV IgM为阴性，系列追踪检测，都相继出现抗-HEV IgM。急性戊型肝炎患者血清HEV RNA的检出多在发病的1～12天内。
　　 研究结论:
　　 1、HEV主要侵犯青壮年，随着年龄的增长重叠感染的比例越高。老年人感染HEV的肝功能损害比年轻人严重；HEV阳性女性患者所占比例较多：HEV重叠HBV感染后肝细胞损害加重，病情趋向重症化。
　　 2、应用巢式RT-PCR方法能对急性散发戊型肝炎患者血清中的HEV RNA进行定性检测，且有较高的特异性和敏感性。在临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平，具有一定的临床应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写词

声明

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 研究对象

2.2 诊断标准

2.3 主要实验试剂和仪器

2.4 实验方法

第3章 结果

3.1 戊型肝炎病毒感染的临床特征和血清学特点

3.2 戊型肝炎病毒重叠感染的临床特征和血清学特点

3.3 巢式逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA

第4章 讨论

4.1 戊型肝炎病毒感染患者的临床特征与血清学特点

4.2 戊型肝炎病毒重叠感染患者的血清学指标变化特点

4.3 戊型肝炎病毒分子生物学诊断的临床意义

4.4 巢式RT-PCR检测HEV RNA的临床应用价值

第5章 结论

参考文献

综述 戊型肝炎病毒的研究进展

攻读学位期间发表和完成的论文

致谢