构建无动物源性的人胚胎干细胞培养体系的研究

摘要

第一部分、无动物源性的人胚胎干细胞培养体系的构建以及与五种人胚胎干细胞培养体系的比较
　　 目的：拟构建一个完全无动物源性(animal-free，AF)的人胚胎干细胞(humanembryonic stem cells，hESCs)培养体系，并将该培养体系与其它五种hESCs培养体系进行比较。
　　 方法：使用10％人血清(human serum,HS)培养的人包皮成纤维细胞，作为完全无动物源性人包皮饲养层(animal-free human foreskin feeder，AF-HFF)，并联合商品化的成分确定培养基(chemical defined medium，CDM)，构建一个完全无动物源性的hESCs培养体系，将其作为研究组A组。对照组B组与A组使用相同的hESCs培养基(即CDM)，但B1组使用10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)培养的含有动物成分的人包皮饲养层(animal-contained human foreskin feeder，A-HFF)，而B2组使用人血清作为基质胶(HS-Matrix)的无饲养层培养体系。对照组C组与A组使用相同的无动物源性饲养层(AF-HFF)，但C1组使用添加20％血清替代物(serum replacement,SR)的干细胞培养基，C2组使用添加20％HS的干细胞培养基。D组为传统的培养体系，由A-HFF联合添加20％SR的干细胞培养基所构成。在培养体系D组中分离得到的两株hESCs系一部分继续在该培养体系中传代培养，一部分转换至其它五种培养体系中继续传代培养。比较无动物源性培养体系和其它培养体系中两株hESCs系的增殖率、克隆形成率、分化率，并用流式细胞术检测未分化表面标记物SSEA-4,TRA-1-60和荧光定量PCR检测多能性因子Oct3/4，hTERT的表达，以及ELISA测定各种培养体系的条件培养基(conditioned medium，CM)中bFGF浓度的变化。同时对AF培养体系中长期传代后的hESCs进行核型及干细胞特性的相关检测。
　　 结果：
　　 1.建立了两株完全无动物源性的人包皮饲养层细胞系，在体外长期传代后均保持正常成纤维细胞的形态，经核型鉴定为正常核型46，XY。
　　 2.AF-HFF和A-HFF的生长形态、增殖周期、支持hESCs未分化生长的能力和分泌bFGF的模式均相似。
　　 3.六种培养体系中，A、B1两组达到稳定培养前以及B2组都有较高的分化率，但是A组和B1组达到稳定培养后(A'组、B1'组)分化率明显降低，其差异有统计学差异(P＜0.003)；克隆形成率在B2组最低，与其它两组的差异有统计学意义(P＜0.003)。A组达到稳定传代后的分化率与C1组、D组的分化率无统计学差异(P＞0.003)，而C2组的分化率高于A组、C1组和D组，其差异具有统计学意义(P=0.000)；C2组的克隆形成率低于其它三组，有统计学差异(P＜0.003)。
　　 4.流式细胞术检测A、B1、B2、C1、C2五组hESCs未分化表面标记物SSEA-4，TRA-1-60的表达：A组≈B1组≈C1组＞B2组≈C2组＞＞A'组。
　　 5.荧光定量PCR检测A、B2、C1、C2四组hESCs多能性因子表达，Oct3/4和hTERT在A组达到稳定传代后和C1组的表达量均高于B2组和C2组的表达量，其差异分别具有统计学意义(P＜0.005)。
　　 6.经过37℃过夜培养后，各组培养基中bFGF的浓度均有明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，但是各饲养层培养体系中下降比例低于无饲养层培养体系中的下降比例，差异分别具有统计学意义(P＜0.005)。
　　 7.两株hESCs系在构建的hESCs培养体系中长期传代超过30代，仍能保持正常核型，分别为46，XY和46，XX，并且表达hESCs未分化表面标记物，体内分化实验可形成畸胎瘤。
　　 结论：通过本实验部分，我们成功地构建了一个完全无动物源性的hESCs培养体系，而且该培养体系维持hESCs长期未分化生长以及多能性状态的能力基本等同于目前传统的含有血清替代物的饲养层培养体系，或者优于其它一些hESCs培养体系。在这个过程中，我们还发现hESCs的生长较少受到饲养层培养血清的质量影响。另外，bFGF在饲养层培养体系中比无饲养层培养体系有更好的稳定性，从一定程度上解释了AF-HFF联合CDM的无动物源性培养体系有效支持hESCs生长的原因。
　　 第二部分、建立无动物源性的人胚胎干细胞系的初步研究
　　 目的：在第一部分构建的完全无动物源性的hESCs培养体系中建立新的hESCs系，以期获得临床级的hESCs系。
　　 方法：用机械法切割废弃胚胎来源的内细胞团(inner cell mass，ICM)，接种到无动物源性培养体系中，对获得的未分化克隆团用机械法传代，经长期培养后进行hESCs相关生物学特性的鉴定。初步构建完全无动物源性的干细胞冷冻方法，并与常规的含动物源性的冷冻方法比较hESCs的复苏率和复苏后的分化率。
　　 结果：1.成功地从废胚来源的囊胚中分离ICM获得一个完全无动物源性的hESCs系(AF-hESCs)。
　　 2.AF-hESC系在体外传代培养超过40代后仍保持未分化状态，表达hESCs表面未分化标记物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和hESCs多能性因子OCT3/4，hTERT，Nanog，SOX2，体外分化实验中可形成类胚体，接种到SCID小鼠皮下形成畸胎瘤。但是hESCs核型异常：46，XX，t(1∶19)(q32；q13.1)，dup(17)(q21.1；q22.2)。
　　 3.hESCs的无动物源性冷冻方法和含动物成分冷冻方法比较，两组复苏率(66.5％VS65.25％，P=0.842)和复苏后的细胞分化率(19.5％VS15％，P=0.369)之间的差异没有统计学意义，且解冻后的细胞核型保持不变，并仍保持干细胞的生物学特性。
　　 结论：我们构建的完全无动物源性的hESCs培养体系具有支持原代hESCs克隆生长的能力，但其安全性待进一步证实，建立效率也有待进一步提高。完全无动物源性的hESCs冷冻-解冻液是有效的，解冻后的hESCs仍保持原有核型及未分化状态。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

前 言

第一部分 无动物源性的人胚胎干细胞培养体系的构建以及与五种干细胞培养体系的比较

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 建立完全无动物源性的hESCs系

前 言

材料与方法

结 果

讨论

小 结

全文总结

展望与不足

参考文献

致 谢