人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

摘要

目的:
　　拟建立一种人胚胎干细胞无饲养层无血清的培养体系，使其能维持人胚胎干细胞未分化的增殖状态及全能性，为人胚胎干细胞进一步的基础研究及将来的临床应用提供有益的探索。
　　方法:
　　在小鼠胚胎成纤维细胞和常用的Knockout培养基共同支持下，扩增人胚胎干细胞X-01，Ⅳ型胶原酶消化传代培养。基质胶铺底后，将人胚胎干细胞分别置于常用的Knockout培养基（1组）、自制无血清培养基（2组）和添加bFGF及肝素的改良无血清培养基（3组）中进行培养。连续培养10代后观察比较三组培养条件下人胚胎干细胞形态学变化、克隆数目及大小情况。同时借助细胞免疫荧光染色、流式细胞术和体外拟胚体形成等方法检测人胚胎干细胞的未分化状态和全能性。
　　结果:
　　1、细胞形态学显示:常用Knockout培养组（第1组）条件下，hESCs X-01细胞具有典型的人胚胎干细胞特征形态，克隆大，饱满，形似鸟巢，细胞间紧密堆积，细胞核大，胞核与胞浆的比例高;自制无血清培养组（第2组）:hESCsX-01克隆呈扁平椭圆形，体积稍小，欠饱满，细胞间较松散，传代3次后逐渐呈分化状，不能连续传代;改良无血清无饲养层培养组（第3组）:克隆形态与第1组相似，克隆大，饱满，克隆内细胞排列紧密，核大，核质比高。
　　2、单位视野下hESCs X-01细胞克隆个数及大小的比较结果显示:常用Knockout培养组（第1组）hESCs X-01细胞单位视野内克隆个数为(5.9±1.0)个，自制无血清培养组（第2组）为(5.0±0.8)个，改良无血清培养组（第3组）为(6.6±0.7)个，第1组与第3组间克隆个数无差异(P＞0.05)，而第2组克隆个数明显少于第1组和第3组(P＜0.05)。第1组hESCs X-01细胞单位视野中克隆大小占整个视野面积的百分比为(51.0±7.6)％，第2组为(41.9±7.6)％，第3组为(55.6±7.9)％，同样第1组与第3组间克隆体积大小无明显差异(P＞0.05)，而第2组克隆体积显著小于第1组和第3组(P＜0.05)。
　　3、免疫荧光染色结果示:hESCs均表达特异性多潜能标志物Nanog、Oct-4、Tra-1-60和SSEA-4等，而不表达SSEA-1。本研究显示常用Knockout培养组（第1组）和改良无血清培养组（第3组）hESCs X-01细胞均表达上述特异性多潜能标志物(Nanog、 Oct-4、Tra-1-60和SSEA-4)，而不表达SSEA-1;而自制无血清培养组（第2组）中上述指标均弱阳性或阴性。
　　4、三组培养条件下分别行流式细胞术检测，结果显示常用Knockout培养组（第1组）和改良无血清培养组（第3组）hESCs X-01细胞高表达特异性表面标志物SSEA-4（表达率分别为84.53％、86.73％），低表达SSEA-1(表达率分别为6.84％、7.34％);而自制无血清培养组（第2组）hESCs X-01细胞较低表达特异性表面标志物SSEA-4（表达率为55.82％），较高表达SSEA-1（表达率为39.43％）。
　　5、拟胚体形成实验结果显示:常用Knockout培养组（第1组）和改良无血清培养组（第3组）条件下培养的hESCs X-01细胞，在MEF培养基中悬浮培养，7d后能体外分化形成囊状拟胚体，而自制无血清培养组（第2组）hESCs X-01细胞逐渐呈分化状，不能持续传代，不能形成拟胚体。
　　结论:
　　本研究通过添加bFGF和肝素来改良本实验室已获得国家专利的无血清培养基，初步建立了一种人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系，能维持人胚胎干细胞未分化增殖状态及全能性，与常用无血清培养体系相比，其培养效果无明显差异，但在便宜的价格、明确的成分、无动物源性污染等方面有很好的优势。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 细胞系

2．1．3 基本材料

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要仪器

2．1．6 主要试剂的配制与储存

2．2 实验方法与步骤

2．2．1 实验分组

2．2．2 原代MEF细胞的制备

2．2．3 MEF细胞的传代

2．2．4 MEF细胞的丝裂霉素C处理及冻存

2．2．5 MEF细胞的复苏及饲养层细胞的准备

2．2．6 hESCs的复苏及培养扩增

2．2．7 hESCs的冻存

2．2．8 条件培养基制备

2．2．9 hESCs无饲养层条件培养基培养

2．2．10 hESCs自制无饲养层无血清培养

2．2．11 hESCs改良无血清无饲养层培养

2．2．12 hESCs克隆计数及克隆大小评估

2．2．13 免疫组织化学法检测

2．2．14 流式检测

2．2．15 体外分化

2．3 统计学分析

第3章 结果

3．1 MEF原代及经丝裂霉素C处理后的形态观察

3．2 不同培养条件下hESc形态观察

3．3 三组条件下克隆个数及大小百分数分析

3．4 免疫荧光染色

3．5 流式细胞术

3．6 体外拟胚体形成

第4章 讨论

4．1 hESCs改良无血清无饲养层培养体系的成功建立

4．2 改良无血清无饲养层培养体系成功维持hESCs生长的可能原因分析

第5章 结论与展望

5．1 小结与结论

5．2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 BFGF／HSPG轴对胚胎干细胞“干性”维持的作用