1.IDO及SOCS1共抑制对树突细胞抗肾癌免疫应答的影响及机制;2.Bmi1基因在肝细胞癌中表达及临床意义

摘要

第一部分IDO及SOCS1共抑制对树突细胞抗肾癌免疫应答的影响及机制
　　 肾癌(RCC)是一种最常见的泌尿系统肿瘤，对传统放疗、化疗不敏感，因此迫切需要寻找有效的治疗手段。肾癌是一种免疫原性较强的肿瘤，因此通过诱导或扩大宿主防御功能，提高机体免疫系统对肿瘤的特异性杀伤力已成为肾癌免疫治疗的研究热点。树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是人体内功能最强大的抗原提呈细胞。抗原负载的DC细胞可以介导免疫抗肿瘤免疫反应。近几年以DC为基础的抗肿瘤免疫治疗已经成为较为常用的体细胞免疫治疗手段之一。吲哚胺-2，3-双加氧酶(Indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO)是近年来新发现的一种重要的免疫负调节因子。IDO的作用是催化色氨酸分子中吲哚环氧化裂解，并使之沿犬尿酸途径作用进行分解代谢。细胞因子信号抑制因子1(Suppressor of CytokineSignaling1，SOCS1)是一种抑制DC细胞活化的负调控因子，对于削弱DC肿瘤疫苗的免疫刺激作用有重要影响。
　　 本课题在现有肾癌树突细胞(DC)肿瘤疫苗研究的基础上，采用siRNA及酶抑制剂方法抑制DC细胞中免疫负调控因子SOCS1及IDO的作用，从而解除DC肿瘤疫苗在抗原提呈及刺激免疫应答时同时启动的免疫负调控效应，进一步增强其抗肾癌的免疫治疗作用。
　　 结果：
　　 1.首先比较了IDO特异性抑制剂右旋型1-甲基色氨酸(D-1MT)及左旋型1-甲基色氨酸(L-1MT)对增强DC细胞抗肾癌免疫反应的影响。结果表明，D-1MT和L-1MT处理后，可以促进DC成熟表型(CD40，CD80，CD83)的表达以及细胞因子IL-12p70的分泌。肾癌细胞裂解物负载DC与自体T淋巴细胞共培养体系中，1MT可以增加CD4+和CD8+淋巴细胞IFN-γ的分泌，增强T细胞杀伤肾癌细胞能力，抑制CD4+CD25+调节性T细胞的水平，这可能与1MT抑制培养基中IDO酶活性有关。1MT对DC诱导T淋巴细胞的增殖以及凋亡方面没有显著影响。与D-1MT相比，L-1MT可以更有效地增强Th1和CTL反应。
　　 2.探讨IDO与SOCS1共抑制对DC细胞抗肾癌免疫应答反应的影响。通过第一章的研究，我们在选择了L-1MT作为IDO的抑制剂。根据DC细胞内吞特性，直接加入化学干扰片段沉默DC细胞SOCS1表达。结果表明，我们设计的SOCS1基因沉默序列可以有效的干扰DC细胞SOCS1的表达。共抑制的DC细胞成熟表型(CD40、CD80、CD83)表达增强，细胞因子IL-12p70分泌增加。共抑制DC细胞诱导增殖的T淋巴细胞对肾癌靶细胞具有更高的杀伤活性。内细胞因子分析结果也表明共抑制组DC细胞诱导增殖的CD4+及CD8+的T淋巴细胞均分泌更高含量的IFN-γ。表明共抑制IDO与SOCS1的DC细胞可有效地诱导Th1型及CTL型T淋巴细胞产生。共抑制组DC细胞可以提高T淋巴细胞的增殖能力，同时其诱导增殖的CD3+CD56+NKT细胞水平提高，对其他细胞亚群没有显著影响。
　　 3.进一步对1MT和干扰SOCS1对DC细胞诱导T淋巴细胞抗肾癌免疫应答的机制进行研究。我们发现，1MT在共培养体系下主要是通过刺激DC细胞起作用，而不能直接作用于T淋巴细胞。1MT可能通过增强STAT1，p38以及NF-κB信号通路发挥作用。而且发现，干扰SOCS1后可以诱导IDO的表达，L-1MT可以抑制IDO的表达。SOCS1基因沉默以及共抑制的DC细胞，其信号分子STAT1、STAT4、p38、JNK以及IκB-α的磷酸化水平有所提高，表明SOCS1基因沉默和共抑制的DC细胞，其免疫功能的增强可能是通过JAK/STAT、MAPK及NF-κB信号通路的增强激活来进行的。
　　 结论：
　　 本研究选择L-1MT作为IDO的抑制剂，并用特异性的siRNA干扰DC细胞SOCS1基因表达可以显著提高T淋巴细胞杀伤肾癌的活性。通过本研究使我们发现一种增强肾癌DC疫苗抗肿瘤免疫应答的新途径，从而为临床研究出更有效，更特异的新型DC抗肾癌疫苗。
　　 第二部分Bmi1基因在肝细胞癌中表达及临床意义
　　 原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，九十年代以来已成为我国第二位的癌症杀手，而且发病率呈逐年上升趋势。肝癌的组织学来源比较单一，肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的组织学类型。HCC具有起病隐匿，侵袭性生长快速，恶性程度高，治疗后易复发，病死率高等特点，尽管治疗手段发展迅速，但肝癌五年生存率仍较低。加强肝癌病因学的研究成为人类目前与肝癌抗争的关键。肝癌相关基因的深入研究，对于阐明肝癌的发病机理，肝癌的早期诊断及开发出新的治疗手段，进而提高肝癌患者的生存率都具有重要的意义。
　　 癌基因过表达在包括肝癌在内的多种实体瘤被广泛报道，在肿瘤的发病机制中其重要作用。Bmi1(B cell specific Moloney murine leukemia virus insertion sitel)属于PcG(Polycomb group,PcG)家族，为过度表达c-myc转基因小鼠中鉴定的原癌基因，与果蝇PcG基因高度同源，在DNA损伤修复、细胞周期调控、染色质的稳定、基因转录激活以及细胞凋亡等方面起着重要的作用。Bmi1通过抑制ink4a位点的表达及调节端粒酶的活性直接参与细胞生长、增殖的调节，并为成体干细胞和白血病干细胞的自我更新所必需。研究证实人类多种肿瘤，如淋巴瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、乳腺癌、肺癌及大肠癌等的发生、发展过程均与Bmi-1基因表达异常有关。最新的基因芯片检测研究发现，在肝癌中Bmi-1有异常表达的现象。然而Bmi-1的异常表达是否与肝癌的预后有直接关系却还未有详细研究。
　　 本研究旨在探讨Bmi1基因在肝癌中的表达，分析其表达水平与临床参数的关系，并且研究Bmi1对肿瘤患者预后的影响。
　　 结果：
　　 1.Bmi1在137例组织中60％阳性表达，29.9％高表达。中高分化肿瘤组织以及肿瘤周围正常组织和肝硬化组织中阳性染色。提示Bmi1的表达可能与肝癌癌前病变恶性转化的过程相关，在肝癌发生发展过程中发挥重要作用。
　　 2.统计分析Bmi1的表达与肝癌组织临床病理参数的关系发现，Bmi1的表达与患者肿瘤大小，分化程度及AFP等没有显著联系。
　　 3.生存分析显示Bmi1高表达患者生存时间较短(p=0.049)，但多因素分析Bmi1的表达并不是一个独立危险因素。然而对24个月以后的患者做多变量统计分析，发现Bmi1的表达成为肝癌患者远期预后的一个独立影响因素(p=0.002)。
　　 结论：
　　 Bmi1基因在肝癌的发生发展中起重要作用，作为肝癌相关癌基因，它的高表达可导致患者远期不良预后。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分IDO及SOCS1共抑制对树突细胞抗肾癌免疫应答的影响及机制

前 言

主要仪器设备与化学试剂

1.主要仪器设备

2.主要化学试剂

3.常用的缓冲液、培养液等溶液的试剂配方

第一章IDO抑制剂增强树突状细胞抗肾癌免疫应答的初步研究

材料与方法

结 果

讨论

第二章共抑制IDO及SOCS1对DC细胞抗肾癌免疫应答的影响

材料与方法

结果

讨 论

第三章IDO及SOCS1共抑制增强树突细胞抗肾癌免疫应答机制的初步研究

材料与方法

结 果

讨论

总 结

第二部分Bmi1基因在肝细胞癌中表达及临床意义

前言

材料与方法

1.主要仪器设备与化学试剂

2.材料

3.实验方法

结 果

1.Bmi1在肝癌组织中的表达

2.Bmi1蛋白表达与肝癌临床病理参数之间的关系

3.Bmi1表达与预后的关系

4.影响生存时间的多因素分析

讨 论

总 结

参考文献

附 录

致谢