结核患者TCRγ9基因CDR3谱型分析及表达结核特异性γδTCR细胞株的构建

摘要

研究背景和目的：
　　 20世纪40年代中后期，结核病的控制措施不断完善，结核病曾一度被抑制，但从80年代中后期开始，随着人口迁移、艾滋病病毒和结核分枝杆菌双重感染、结核耐药的出现，结核病死灰复燃，又逐渐成为全球范围内严重危害人类健康的慢性传染病之一。目前，全世界约20亿人口感染了结核分枝杆菌(Mycobac teriumtu berculosis，MTB)，每年新发患者约900万，死亡人数高达300万。结核病由感染MTB引起。MTB为兼性胞内寄生菌，寄生于巨噬细胞内进而侵犯人体。抗MTB是以CD4+T细胞为主的特异性细胞免疫为主。T细胞通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)特异性地识别抗原递呈细胞递呈的结核抗原，发挥抗MTB免疫作用。
　　 T细胞按其抗原受体不同可分为两型，一种称为αβT细胞，表达TCRαβ；另一种称为γδT细胞，表达TCRγδ。在外周血中，αβT细胞占成熟T细胞的90％～95％，而γδT细胞仅占5％～10％。TCRγ链和δ链与CD3分子以非共价连接成TCRγδ-CD3复合物表达于γδT细胞表面。TCR的γ和δ链分别由V/J/C及V/D/J/C基因片段重排后编码，形成γδTCR分子的多样性，从而产生数量众多的特异性抗原受体，识别不同的抗原。目前，已知人的γ链V区基因片段有15个(7个假基因)，5个J区基因片段(分为γJ1和γJ2两组)，2个C区基因片段；δ链有6个V区，3个D区，3个J区和1个C区基因片段。与αβT细胞相似，γδT细胞抗原结合部位有三个区即CDR1、CDR2、CDR3，其中起主要作用的是CDR3区。TCR重排形成多种多样的CDR3区，我们通过对CDR3区谱型分析，可判别T细胞克隆性增殖。
　　 生物素-亲和素系统以生物素和亲和素具有独特结合特性为基础，偶联大分子生物活性物质，具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用广泛的特点。四聚体技术中利用了这一系统，将生物素化的四个单体分子与链霉亲和素结合形成四聚体，大大增加了免疫反应作用位点，提高了检测效率。
　　 人类γδT细胞通常是Vγ9和Vδ2配对，Vγ9Vδ2T细胞占外周血γδT细胞的50％～95％，并且有许多研究发现Vγ9Vδ2T细胞在抗MTB免疫中起重要的免疫保护作用。
　　 本课题的目的：拟以活动性结核胸膜炎患者和活动性肺结核患者胸水和外周血作为研究对象，从中分离出淋巴细胞，再针对TCRγ9链序列进行PCR扩增。扩增产物进行克隆并测序，结果利用DANMAN、DNAstar软件及网上TCR资源比对，分析活动性结核病患者是否具有特异性γδT细胞的克隆性增殖，研究TCRγ9基因重排的特点及CDR3区谱型；建立稳定分泌表达γδTCR的细胞株。我们更进一步的目的是利用这些细胞株制备结核特异性γδTCR四聚体，利用其深入研究γδT细胞在抗结核免疫中的作用，为探索和研究其抗MTB作用以及作为结核诊断试剂、结核新型疫苗的可能性建立基础。
　　 研究内容和方法：分离活动性结核胸膜炎患者和活动性肺结核患者胸水(PLF)标本和外周血标本(PB)、正常人外周血标本及肺部肿瘤患者外周血和胸水标本中的淋巴细胞，提取其总RNA，利用Switch Mechanism At5'-end of Reverse Transcript(SMART)技术逆转录获得淋巴细胞总cDNA，并通过LD-PCR合成第二链。根据GeneBank中已有的TCRγ9链序列，设计三对引物分别扩增TCRγ9链的V区、CDR3区及C区。其中V区的上游引物包括TCRγ9链先导序列起始密码，下游引物根据V区相对保守序列设计；CDR3区的上游引物根据V区的相对保守序列设计，下游引物根据C区保守序列设计；C区的上下游引物根据C区保守序列设计，并且下游引物包括终止密码。同时，在V区上游引物、C区下游引物5'端分别引入两种酶切位点。得到的三段扩增产物克隆入pGEM-Teasy载体，经过蓝白筛选得到阳性克隆，委托公司测序。测序结果利用DNAMAN软件及网上TCR基因资源进行分析、比对，研究TCRγ9链的CDR3区谱型，得到不同的TCRγ9基因序列。另外，通过与正常人外周血标本和肺部肿瘤患者外周血及胸水标本中扩增到的TCRγ9链的CDR3区序列比对，筛选结核特异性TCRγ9基因。通过OverlapPCR将TCRγ9链的V区、CDR3区、C区重叠成完整的TCRγ9全长编码序列，将得到的不同TCRγ9基因去除跨膜区和胞内区编码序列并且在C端连入极性性氨基酸编码序列和生物素化酶底物基因，克隆入载体pMT/V5/HisB构建分泌表达载体，再与TCRδ2链重组分泌表达载体、BirA重组表达载体及潮霉素筛选质粒共转染果蝇S2细胞后以生物素化的异二聚体的形式分泌表达，筛选恒定细胞株；以Dotblotting、SDS-PAGE、Westernblotting等技术初步鉴定表达效果。
　　 研究结果：
　　 本课题分别对12例活动性结核患者胸水标本和9例活动性结核患者(包括结核性胸膜炎或肺结核)外周血标本进行了完整的TCRγ9链编码序列的扩增。标本统一编号为1～18，其中1、2、3号标本同时包含胸水及外周血标本；4～12号标本单独为胸水标本；13～18号标本仅为外周血标本。共扩增克隆得到不同的TCRγ9基因16个。同时，从5例正常人外周血标本(编号为C1～C5)和1例肺部肿瘤患者的胸水及外周血标本(编号为Tp和Tb)中扩增TCRγ9基因作为对照。正常人对照组共得到2个不同的TCRγ9链序列，肺部肿瘤患者对照组得到2个TCRγ9链序列。
　　 将所得序列与网上TCR资源比对分析后，发现TCRγ9链的V区全部是GV9*01，而J区则以JP*01为主，个别标本出现JP*02a，J1*02或J2*01。并且，在大部分TCRγ9链基因的V区与J区之间有N片段插入或者N、P片段共同插入。对TCRγ9链CDR3区氨基酸序列分析显示：在同一个患者胸水和外周血标本中扩增得到一些相同CDR3区序列，如1、2、3号标本胸水和外周血标本中都有CDR3区氨基酸序列“ALWGTLQELGKKIKV”。此外，虽然同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性，但是不同病例之间也发现有一些相同或相似的氨基酸序列，如4、5、6、7、9、10、11、12、14、18号标本有相同CDR3区氨基酸序列“ALWEVQELGKKIKV”；1、2、3、8、9、10、12、13、17号标本有相同CDR3区氨基酸序列“ALWGTLQELGKKIKV”等。除此，我们还发现在不同克隆中存在相同氨基酸基序“ALWE…ELGKKIKV”。进一步分析比较发现“ALWEVQELGKKIKV”仅出现在多个结核患者标本中。从正常人和肺部肿瘤患者标本中分别获得的2个TCRγ9链CDR3区基因与结核患者标本中序列相同。“ALWEVIGELGKKIKV”、“ALWGTLQELGKKIKV”和“ALWEVLELGKKIKV”这三个序列分别在结核患者与正常人，结核患者与肺部肿瘤患者，或结核患者与正常人、肺部肿瘤患者标本中出现。
　　 构建了4个TCRγ9链pMT重组分泌表达载体，分别与适合的TCRδ2链pMT重组分泌表达载体配对，与BirA质粒、潮霉素筛选质粒共转染果蝇S2细胞。获得1株稳定分泌表达Vγ9Vδ2TCR单体的细胞株。
　　 结论：
　　 1.研究中采用SMART和LD-PCR的技术方法克服样本量小的问题，利于对一份样本进行多个方面的研究。
　　 2.设计引物分别扩增TCRγ9链的V区、CDR3区及C区，并采用OverlapPCR方法将三者拼接为TCRγ9链全长编码序列，克服了γδTCR基因扩增的困难。
　　 3.CDR3区谱型分析提示：结核患者存在γδT细胞的克隆性增殖。克隆增殖的γδTCRCDR3区氨基酸序列呈现多样性的特点，但是在同一病例及不同病例之间找到一些相同、结核患者独有的CDR3区氨基酸序列或者出现频率较高的氨基酸基序。推测具有这些相同、独有的CDR3区氨基酸序列的γδT细胞可能与MTB特异性抗原的识别有关，而在结核患者与正常人、肺部肿瘤患者标本中发现的具有相同CDR3区氨基酸序列的γδT细胞则可能与共有抗原的识别及参与早期抗结核非特异性免疫等有关。
　　 4.构建了4个TCRγ9基因重组分泌表达载体，获得稳定分泌表达Vγ9Vδ2TCR单体细胞株1株。分泌表达的蛋白经大量诱导表达纯化后可进一步用于制备Vγ9Vδ2TCR四聚体，为将来研究γδT细胞在抗结核免疫中的作用、探索和发展结核诊断与新型疫苗奠定了基础。

目录

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前言

实验材料

实验技术路线

实验方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

附录

致谢