大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰

摘要

番茄红素是类胡萝卜素的一种，具有极强的抗氧化能力和消除自由基的能力，其在抗衰老和防癌方面的功能受到人们越来越多的关注。使用番茄为原料制备番茄红素的方法成本较高且提取率不高，不适用于工业生产，因而人们主要应用微生物发酵的方法制备番茄红素。与天然产番茄红素的微生物相比，应用基因工程构建的产番茄红素大肠杆菌具有发酵时间短、安全、经济等优点，是工业化生产的主要备选菌种。
　　 在本研究中，主要应用代谢工程和定向进化的技术方法对产番茄红素大肠杆菌的代谢途径进行了修饰，目的是获得提高番茄红素产量的大肠杆菌工程菌。以代谢途径关键酶基因dxs和细胞中的转录调控因子rpoS为对象，进行了基因组合表达、启动子替换与定向突变，均提高了番茄红素的产量。然而对结果进行整合与筛选后，番茄红素产量并未继续提高。得出以下结论:
　　 首先，关键酶基因dxs和转录调控因子rpoS的过量表达能够定向提高代谢流，从而提高番茄红素产量73.6％和133.6％。
　　 第二，基因组的基因表达效果强于质粒载体的表达效果，T5启动子替换后的E.coliBW25113(△gdhA，△aceE，T5-dxs，pAC-LYC04)菌株能够有效提高番茄红素产量124.4％。
　　 第三，通过易错PCR突变方法，获得的突变基因D2、D23及R23，较未突变菌株能够有效提高番茄红素产量17.1％、20.5％、36.0％。

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论文说明：缩略语表

声明

第1章 前言

1.1 番茄红素简介

1.2 代谢工程简介

1.3 细胞全局调控简介

1.4 定向进化简介

1.5 研究目的及意义

第2章 材料与试剂

2.1 载体与菌株

2.2 主要培养基

2.3实验药品与试剂

2.4主要仪器与设备

第3章 实验方法

3.1 克隆与表达

3.2 基因敲除与替换

3.3 易错PCR

3.4 番茄红素的测定

第4章 结果与讨论

4.1 基因过量表达

4.2 dxs修饰对番茄红素合成的影响

4.3 rpoS修饰对番茄红素合成的影响

4.4 多种策略的整合

第5章 结论与展望

参考文献

致谢